birmaga.ru
добавить свой файл

1
РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В ЛАБОРАТОРНУЮ ПРАКТИКУ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АЛЛЕЛИ HLA B*5701 ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ С ЦЕЛЬЮ ИСКЛЮЧЕНИЯ СЛУЧАЕВ ВОЗНИКНОВЕНИЯ РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ АБАКАВИР-СОДЕРЖАЩЕЙ ТЕРАПИИ.
Киреев Д.Е., Куевда Д.А.

ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия.

Введение.

В настоящее время во многих странах, в том числе и в России, широко используется антиретровирусный препарат абакавир. Абакавир является нуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы и применяется совместно с другими антиретровирусными препаратами для лечения ВИЧ-инфекции. Несмотря на его эффективность, существует серьезное ограничение при назначении пациенту вследствие возможного возникновения реакции гиперчувствительности (РГЧ). РГЧ к абакавиру – это мультиорганный клинический синдром, обычно проявляющийся в течение первых 6 недель после начала приема абакавира. В случае отмены препарата симптомы РГЧ пропадают, однако в случае повторного применения, более серьезные, они возникают вновь и могут явиться причиной смерти пациента. В 2002 году была обнаружена связь между возникновением РГЧ и наличием у пациента аллели B*5701 главного комплекса гистосовместимости I-го класса. Дальнейшие клинические исследования, проведенные в Западной Австралии, Великобритании и Франции, подтвердили сильную корреляцию РГЧ и носительства HLA-B*5701. Для окончательного подтверждения гипотезы было проведено широкомасштабное исследование PREDICT. Это было проспективное двойное слепое исследование, включавшее 1660 пациентов, которым планировалось назначение схемы антиретровирусной терапии с абакавиром. Пациенты были разделены на две группы: контрольную и исследуемую. Всем пациентам контрольной группы была назначена абакавир-содержащая терапия, в то время как пациентам исследуемой группы сначала был проведен анализ на наличие аллели B*5701 и только в случае ее отсутствия назначалась терапия, содержащая абакавир. По результатам исследования прогностическая ценность отрицательного результата анализа составила 100%. В настоящее время по американским, европейским и российским рекомендациям по лечению ВИЧ-инфицированных анализ на наличие аллели В*5701 необходимо проводить перед назначением абакавир-содержащей терапии.

Цель и задачи.

Целью нашей работы являлось создание теста для обнаружения аллели HLA B*5701, его валидация относительно референсных методик и клиническая апробация в соответствующих медицинских учреждениях.


Материалы и методы.

Материалом при разработке и валидации теста служили 13 референсных образцов ДНК и зашифрованная панель, содержащая 384 образца ДНК. Обе группы были заранее охарактеризованы референсной методикой SSP (sequence specific primers), а образцы содержащие аллель B*5701 дополнительно проанализированы методом секвенирования. Образцы были любезно предоставлены доктором E. Hammond (Murdoch University, Австралия). Клиническая апробация набора реагентов проводилась на 300 образцах крови, либо соскобах со слизистой ВИЧ-инфицированных и здоровых доноров, собранных на территории России.

Основные результаты.

На первом этапе разработки теста, на основании выравнивания нуклеотидных последовательностей аллелей главного комплекса гистосовместимости человека 1-го и 2-го классов были подобраны специфические олигонуклеотиды. Данные олигонуклеотиды были расположены таким образом, чтобы происходила эффективная амплификация фрагмента ДНК аллелей, относящихся к группы В*57. Дальнейшая дискриминация производилась с помощью меченого олигонуклеотида (зонда). Такая система с помощью метода ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме “реального времени” позволяла обнаруживать только аллель В*5701 и несколько других редко встречаемых аллелей группы В*57 и дискриминировать все остальные аллели.

Результаты тестирования ДНК от 13 референсных образцов, содержащих следующие варианты аллелей 08**, 0801, 15**, 1502, 25**, 27**, 3701, 40**, 4001, 4201, 44**, 4403, 51**, 5101, 5301, 55**, 5701, 5703, 5704, 5801, 61**, показали 100%-ную специфичность методики. Были получены флуоресцентные кривые, свидетельствующие о положительном результате, у 3-х образцов, содержащих аллель В*5701. Для остальных 10 образцов, в том числе образцов, содержащих близкородственные аллели 5703 и 5704, были получены отрицательные результаты.

На следующем этапе разработанный тест валидировался с помощью зашифрованной панели, содержащей 384 образца ДНК. После получения результатов тестирования разработанной методикой панель была расшифрована. Данная панель содержала 317 отрицательных образцов, 34 положительных образца и 33 невалидных образца для проверки отсутствия контаминации во время анализа. Результаты тестирования панели разработанным тестом полностью совпали с результатами, полученными в университете Австралии с помощью референсной методики.


Необходимо было также подобрать эффективный метод ДНК из клинического материала. Основными видами клинического материала для разрабатываемого теста являются цельная кровь и соскоб со слизистой, как быстрый и неинвазивный способ получения клеток пациента. Для таких видов клинического материала наиболее хорошо подходит преципитационный метод выделения нуклеиновых кислот (например, набор реагентов «РИБО-преп» производства ФГУН Центрального НИИ эпидемиологии). Результаты экспериментов показали, что данный набор отлично подошел для вышеуказанных целей, позволяя менее чем за час провести качественное выделение ДНК из 10 образцов. Для повышения надежности теста одновременно с амплификацией мишени – аллели В*5701, в пробирке производится амплификация гена β-глобина, позволяя проводить оценку качества взятия материала и выделения ДНК.

На заключительном этапе разработки тест был валидирован на 300 образцах крови, либо соскобах со слизистой ВИЧ-инфицированных и здоровых доноров, собранных на территории России. Из 300 протестированных образцов было выявлено 17 положительных, наличие аллели В*5701 в которых было затем подтверждено с помощью методики SSP. Таким образом, распространенность аллели HLA B*5701 в наших исследованиях составила 5,67%. Эти результаты согласуются с данными по распространенности HLA B*5701 в Европе (5-8%).

После окончания разработки в ГИСК им. Л.А. Тарасевича были проведены испытания набора реагентов. В результате успешных испытаний набор был разрешен к производству и применению в РФ и получено регистрационное удостоверение в МинЗдравСоцРазвития (№ФСР 2009/06189 от 3 декабря 2009 года).

Заключение.

Использование антиретровирусного препарата абакавир ограничивается необходимостью проведения тестирования ВИЧ-инфицированных на наличие аллели HLA B*5701 перед его назначением. Проведение анализа с помощью референсных методов, таких как SSP и секвенирование, в лечебно-профилактических учреждениях затруднено вследствие отсутствия стандартизации процедуры анализа и учета результатов. Велика необходимость в наличии простого и надежного метода, не уступающего по качеству “золотому” стандарту. Разработанный в Центральном НИИ эпидемиологии набор реагентов позволяет менее чем за три часа провести подобный анализ и для его использования необходимо оборудование, доступное в большинстве лабораторий центров СПИД. Данный метод прошел несколько этапов валидации, зарегистрирован в Российской Федерации и может быть использован в клинико-диагностических лабораториях центров по борьбе и профилактике со СПИД и других профильных учреждениях.