birmaga.ru
добавить свой файл

1 2 3


На правах рукописи


Сапегин

Александр Анатольевич

Клинико-лабораторные критерии тканевой инсулинорезистентности У БОЛЬНЫХ коронарным атеросклерозом

14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург – 2012

Работа выполнена в ФГВОУ ВПО ВМА им. С.М. Кирова МО РФ
Научный руководитель:

доктор медицинских наук Дрыгин Алексей Никонорович
Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Молчанов Олег Леонидович

доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии

им. В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения и социального развития России.

Защита диссертации состоится «27» марта 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д. 215.002.08 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6)


С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «___» февраля 2012 года
Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Митин Юрий Алексеевич
ОбЩая характеристика работы

Актуальность проблемы. Актуальность изучения коронарного атеросклероза (КА) определяется исключительно быстрым ростом заболеваемости. Ишемическая болезнь сердца (ИБС), обусловленная атеросклеротическим поражением коронарных артерий сердца, стоит на первом месте среди сердечно-сосудистых причин смерти, составляя около 49% в структуре смертности больных на территории России (Дедов И.И., Балаболкин М.И., 2004; Дедов И.И., 2007, 2008; Conroy R.M., 2003; Nathan D.M., 2009). Смертность от ИБС у мужчин в возрасте до 65 лет в 3 раза выше, чем у женщин, в более старшем возрасте уровни смертности у обоих полов выравниваются (Чазов Е.И., 2000; Дудко В.А., 2003; Оганов Р.Г., 2005; Davies M.J., 1985; Chugh S.S., 2008; Liu S., 2009). Согласно крупным эпидемиологическим исследованиям частота инфаркта миокарда и острых нарушений мозгового кровообращения у больных сахарным диабетом (СД) в 2-3 раза выше, чем в общей популяции (Смоленская О.Г., Макарова В.Л., 2007; Аметов А.С., 2011; Davies M.J., 1985; Marso S.P.,; Boes E., Coassin S., 2008). СД приводит к 3-кратному повышению риска развития сердечно-сосудистых осложнений (ССО) у мужчин и 9-кратному у женщин. При этом инвалидность и смертность у больных СД существенно выше, чем у лиц без СД (Аметов А.С., Пьяных Э.Н., 2011; Marks J.B., Raskin P., 2000; Juutilainen A., 2004; Ferrarezi D.A., 2007).


Современная медицина поддерживает концепцию факторов риска (ФР) как возможных причин развития и прогрессирования заболеваний сердечно-сосудистой системы (Дедов И.И., 2006; Гуревич В.С., 2008; Мельниченко Г.А., 2009; Davies M.J., 1985; Drygin A.N., 2010). Риск развития КА и ИБС существенно увеличивается при наличии таких известных ФР, как мужской пол, пожилой возраст, дислипидемия, артериальная гипертензия (АГ), курение, СД, низкая физическая активность, злоупотребление алкоголем (Гуревич В.С., 2008; Lloyd-Jones D.M., 1999; Adler A., 2000).

Кроме того, сохраняется тенденция к увеличению заболеваемости СД и сопряженным с ним повышением риска возникновения КА. На сегодняшний день не существует единого мнения о взаимообусловленности атеросклероза и СД. Большинство исследователей пришло к выводу, что атеросклеротический процесс, в частности, осложняет течение сахарного диабета преимущественно второго типа – СД2 (Балаболкин М.И., 2000; Удовиченко О.В., 2001; Дедов И.И., 2004; Чазова И.Е., 2004; Шестакова М.Ф., 2008; Мельниченко Г.А., 2009; Дрыгин А.Н., 2010; Pickup J.C., 2004; Stirban A., 2006). С другой стороны, при специальном обследовании больных, страдающих атеросклерозом, более чем у половины пациентов выявляются разной степени выраженности нарушения углеводного обмена (Яковлев Г.М., Кожемякин Л.А., 1990; Раков А.Л., Дрыгин А.Н., 1991; Дрыгин А.Н., Шустов С.Б., 2010; Mari A., 1997; Jayasinghe S.R., 2009; Drygin A.N., 2010). Клиническая картина ИБС у больных СД2 имеет свои особенности.

Нередко, несмотря на выраженный атеросклеротический коронаросклероз, у этих больных основной клинический признак – стенокардия отсутствует, что по мнению ряда авторов связано с развитием автономной диабетической нейрокардиопатии, характерной для больных СД2. Это в значительной мере затрудняет диагностику ИБС. Течение ИБС при СД2 более тяжелое, что обусловлено, в первую очередь, сопутствующими диабетической дистрофией миокарда и макроангиопатией сосудов сердца (Дедов И.И., 2006; Гуревич В.С., 2008; Мельниченко Г.А., 2009; Дрыгин А.Н., Шустов С.Б., 2010; Thomas A.C., 1986; Kassi E., 2011; Boudina S., 2010).


Хорошо известно, что СД2 способствует прогрессированию атеросклероза и является одним из основных факторов риска хронической ИБС, ишемической болезни мозга, облитерирующего атеросклероза нижних конечностей. Однако конкретные механизмы, влияющие на прогрессирование атеросклероза при разных типах СД, остаются не вполне ясными (Давиденкова Е.Ф., 1990; Дудко В.А., 2003; Алексеева О.П., 2010; Аметов А.С., 2011; Marso S.P., 1999; Tarantino G., 2011).

Можно считать общепринятым представление о том, что СД2 благоприятствует развитию атеросклероза, в том числе и коронарного. Полученные свидетельства «атерогенного» влияния гиперинсулинемии на показатели липидного обмена, подтверждают роль СД2, как одного из важных факторов риска ИБС. Тем не менее, нельзя полностью согласиться с точкой зрения ряда исследователей, отождествляющих СД2 и атеросклероз (Давиденкова Е.Ф., Либерман И.С., 1990; Дрыгин А.Н., Шустов С.Б., 2010; Owerbach D. et al., 1984, Reaven G.M., 1988; Stary H. C., 1994; Kumar A., 2010).

Характер изменений показателей метаболизма и гормональной регуляции под влиянием нагрузки инсулином у больных ИБС в целом не тождественен соответствующим изменениям у больных СД2. Тем не менее, ряд общих черт, таких как наклонность к гиперинсулинемии, признаки тканевой ИР, а также уменьшение регулирующего влияния инсулина на процессы липидного обмена, сближает эти две формы патологии и может свидетельствовать о наличии общих патогенетических факторов в формировании КА (Кожемякин Л.А., 1990; Раков А.Л., 1991; Макарова В.Л., 2007; Дрыгин А.Н., Шустов С.Б., Пастушенков В.Л., 2010; Lamb R.E., 2008; Tarantino G., Caputi A., 2011).

В этой связи представляется перспективным проведение комплексных исследований обменных процессов у больных коронарным атеросклерозом и СД2 с параллельной оценкой показателей внутриклеточного метаболизма в ходе нагрузочных проб ex vivo для выявления наличия или отсутствия общих патогенетических механизмов.

Цель исследования:


Изучить метаболические особенности процессов свободно-радикального окисления и углеводного обмена, разработать клинико-лабораторные критерии оценки тканевой инсулинорезистентности у больных КА.
Задачи исследования:

1. Оценить различия процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) на клеточных моделях ex vivo у больных КА по сравнению со здоровыми пациентами и больными СД.

2. Изучить изменения процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, активности ферментов углеводного обмена в клеточных моделях при действии стимуляторов пероксидации липидов ex vivo у больных КА, СД и у здоровых пациентов.

3. Изучить влияние инсулина на процессы свободно-радикального окисления (СРО) и активности ферментов углеводного обмена в клетках ex vivo у больных КА, СД и здоровых лиц после инициации ПОЛ.

4. Разработать метаболические критерии оценки выраженности тканевой инсулинорезистентности у больных коронарным атеросклерозом.

Научная новизна:

1. Экспериментальным путём на клеточных моделях ex vivo получены новые доказательства различия внутриклеточных метаболических процессов в инсулинозависимых клетках у больных КА, СД и здоровых лиц.

2. Впервые установлена достоверная зависимость между степенью нарушения внутриклеточного метаболизма глюкозы и активностью пероксидации липидов в инсулинозависимых клетках у больных КА при действии стимуляторов пероксидации липидов ex vivo.

3. Получены новые данные о механизмах, лежащих в основе метаболических нарушений на субклеточном уровне у больных КА при проведении нагрузочных проб.

Практическая и научная значимость:

1. Разработаны новые клинико-лабораторные критерии тканевой инсулинорезистентности у больных КА.

2. Предложены лабораторные маркеры метаболических нарушений процессов СРО в инсулинозависимых клетках у больных КА.

3. Разработан алгоритм выполнения лабораторных исследований нарушения углеводного обмена в инсулинозависимых клетках у больных КА.


4. Диабетоподобные метаболические нарушения выявлены в инсулинзависимых клетках у больных КА в условиях проведения функционально-нагрузочной пробы ex vivo.

5. Получены новые данные о метаболических механизмах в патогенезе развития тканевой инсулинорезистентности у больных КА.

6. Результаты исследований используются в лечебно-диагностической практике и учебном процессе на кафедрах и в клиниках ФГВОУ ВПО ВМА им. С.М. Кирова МО РФ и ФГБУЗ КБ №122 им. Л.Г. Соколова ФМБА России.

7. Поданы два изобретения и четыре рационализаторских предложения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Диабетоподобный метаболический синдром у больных коронарным атеросклерозом характеризуется нарушениями процессов свободно-радикального окисления и углеводного обмена ex vivo в инсулинозависимых клетках.

2. Диабетоподобные метаболические нарушения у больных коронарным атеросклерозом выявляются в клеточных моделях под влиянием активации процессов перекисного окисления липидов ex vivo .

3. Функционально-нагрузочные пробы ex vivo позволяют верифицировать тканевую инсулинорезистентность у больных коронарным атеросклерозом.

Личный вклад автора. Цель, задачи, основные положения диссертации и её содержание разработаны автором на основании анализа более 28 тысяч проведённых исследований образцов крови 232 пациентов с КА, 76 больных СД и 91 обследуемого контрольной группы.

Автором разработана рабочая гипотеза о диабетоподобных метаболических нарушениях в инсулинозависимых клетках ex vivo у больных КА. Проведен выбор адекватных современных лабораторных методов исследования метаболических нарушений. Клинико- лабораторные исследования, а также статистическая обработка и анализ полученных результатов проводились автором самостоятельно. Доля участия автора в накоплении научной информации более 80%, а в обобщении и анализе полученных результатов – до 100%.

Апробация работы. Основные положения работы отражены в 12 опубликованных работах, в том числе 6 в научных изданиях, рекомендованных ВАК.


Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 25 рисунков. Указатель литературы состоит из 187 источников (119 отечественных и 68 зарубежных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Реализация целей и задач настоящего исследования потребовала проведения серии из 4 относительно самостоятельных клинико-экспериментальных научно-исследовательских работ, в ходе которых проведено обследование 399 пациентов, из них: 232 больных коронарным атеросклерозом (основная группа), 76 больных сахарным диабетом (группа сравнения) и 91 здорового лица (контрольная группа).

Исследования осуществлялись на кафедрах клинической биохимии и лабораторной диагностики, 1-й терапии (усовершенствования врачей) им. Н.С. Молчанова ФГВОУ ВПО ВМА им. С.М. Кирова МО РФ и ФГБУЗ КБ № 122 им. Л.Г. Соколова ФМБА России.

Методологической основой исследования явилось изучение клинико-лабораторных показателей углеводного и липидного обмена, процессов СРО при проведении функционально-нагрузочных проб ex vivo. В качестве нового методического приема для моделирования различных условий изучения процессов на субклеточном уровне исследования проводились с применением клеточных моделей с эритроцитами здоровых, больных коронарным атеросклерозом и сахарным диабетом.

Функционально-нагрузочные пробы:

I. На клеточных моделях ex vivo:

- активация процессов СРО (по методу В.И. Куликова и УФО);

- нагрузочная проба инсулином.

Распределение обследованных больных в зависимости от вида исследований и проводившихся функционально-нагрузочных проб представлено в таблице 1.

Таблица 1

Группы обследованных больных в зависимости от вида исследований и проводившихся функционально-нагрузочных проб

Виды нагрузочных тестов


Контингенты исследованных

Здоровые

КА

СД2

СД1

Всего

активация СРО

91

232

62

14

399

УФО эритроцитов

91

232

62

14

399

проба с инсулином

35

121

30

10

126

ВСЕГО:

217

585

154

38

994


Более подробная характеристика обследуемых здоровых и больных в группах наблюдения приведены в главах собственных исследований.

Лабораторные методы исследования, использовавшиеся для оценки состояния метаболизма, условно подразделялись на 4 группы:

1. Традиционные лабораторные методы, применяющиеся в клинической практике.

2. Лабораторные методы определения концентрации в плазме крови иммунореактивного инсулина (ИРИ) и С-пептида, участвующих в регуляции углеводного обмена.

3. Лабораторные методы определения показателей ПОЛ и антиоксидантной системы.

4. Лабораторные методы определения основных показателей углеводного обмена и активности внутриклеточных ферментных систем.


Взятие крови из локтевой вены осуществлялось с помощью вакуумных систем Venosafe «Terumo» (Бельгия).

Для определения исследуемых показателей использовались

унифицированные методы биохимического и иммунохимического анализа с применением коммерческих наборов реактивов отечественных и зарубежных производителей.

Перечень и общее количество лабораторных исследований, осуществленных при проведении функционально-нагрузочных проб, представлены в таблице 2.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета прикладных программ ЕХCЕL-95 и Statistica 7.1, достоверность между полученными показателями в сравниваемых подгруппах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона–Манна–Уитни (Платонов А.Е., 2000; Рослый И.М., 2010).

Традиционные методы лабораторных исследований выполнялись на гематологическом анализаторе LH500 «Beckman Coulter» (США), биохимические – на анализаторе AU400 «Beckman Coulter» (США), коагулологические – на анализаторе ACL200 «Instrumentation Laboratory» (США) и др.

Таблица 2

Клинико-лабораторные тесты, использованные в работе

Перечень показателей

Виды нагрузочных тестов

Всего

Клеточная тест-система

активация СРО

проба с инсулином

УФО эритроцитов

Интакт-ные

1

2

3

4

5

6


Глюкоза

399

399

126

399

1323

ИСЭ

399

399

126

399

1323

ПГЭ

399

399

126

399

1323

ДК

399

399

126

399

1323

ВГ

399

399

126

399

1323

СОД

399

399

126

399

1323

ФФК

399

399

126

399

1323

Г–6–ФДГ

399

399

126

399

1323

С–пептид

-

-


-

399

399

ИРИ

-

-

-

399

399

Всего:

3192

3192

1008

3990

11382


Методы определения концентрации гормонов. В работе для определения концентрации в крови С-пептида и ИРИ использовался иммунохимический анализ. Исследования по определению С-пептида и иммунореактивного инсулина проводились на иммунохимическом анализаторе ADVIA CENTAUR c использованием оригинальных коммерческих наборов производства «Siemens Healthcare Diagnostics Inc.» (США). Принцип метода: в основу метода положена иммунологическая реакция образования иммунных комплексов. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов (антиген-антитело) используется метка, с которой предварительно связывается узнающий компонент (антиген или антитело). В качестве хемолюминесцентной метки используется сложный эфир акридина. Регистрация результатов анализа заключается в оценке интенсивности хемилюминесценции.

Методы определения показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. Метод определения концентрации (ДК). Определение концентрации ДК в гемолизате эритроцитов осуществляли по методике Стальной И.Д. (1977) в модификации Глушкова С.И. (2001). Принцип метода основан на экстракции ДК из исследуемого материала и измерении их концентрации по характерному спектру поглощения с максимумом при длине волны 233 нм.

К 0,5 мл гемолизата эритроцитов, разведенного 5 мМ ТРИС-НСl буфером с рН 7,6 в соотношении – 1:19, добавляли 4,5 мл экстрагирующей смеси гептана и изопропилового спирта, приготовленной в соотношении 1:1 по объему. Пробирки плотно закрывали полиэтиленовыми пробками и тщательно перемешивали активным встряхиванием в течение 5 мин, после чего давали отстояться (до образования четкой границы между фазами), отбирали 0,5 мл гептановой (верхней) фазы и добавляли к ней 2,5 мл этилового спирта (96°). Оптическую плотность раствора определяли в кювете с длиной оптического пути 10 мм против этилового спирта с гептаном (соотношение 5:1) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 233 нм. Концентрацию ДК рассчитывали с учетом разведения, используя молярный коэффициент светопоглощения на указанной длине волны, и выражали для гемолизата эритроцитов в мкмоль/л.


Метод определения концентрации (МДА). Концентрацию МДА определяли по методу Uchiyama М. (1978); в модификации Глушкова С.И. (2001). Принцип метода основан на взаимодействии между МДА и тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в кислой среде при высокой температуре с образованием окрашенного триметинового комплекса, имеющего максимум поглощения на длине волны 532 нм. К 0,3 мл гемолизата эритроцитов, разведенного 5 мМ ТРИС-НCl буфером с рН 7,6 в соотношении 1:19, добавляли 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты и 1 мл 0,6% раствора тиобарбитуровой кислоты («Sigma», США). При этом рН смеси находился в интервале от 1,6 до 1,8, что представляло оптимальную зону для проведения ТБК-реакции с гомогенатами тканей. Закрытые крышками пробирки инкубировали на кипящей водяной бане в течение 45 мин. После охлаждения проводили экстракцию ТБК-продуктов добавлением 3 мл н-бутанола. Бутанольные экстракты фотометрировали на спектрофотометре СФ-26 в кювете с длиной оптического пути 10 мм на двух длинах волн (532 и 580 нм) против н-бутанола. Концентрацию ТБК-продуктов рассчитывали согласно методике Гаврилова В.Б. (1987) по разнице оптических плотностей с учетом разведения, коэффициента пересчета и выражали для гемолизата эритроцитов в мкмоль/л.

Метод определения концентрации ВГ. Концентрацию ВГ в гомогенатах исследуемых тканей и в гемолизате эритроцитов определяли с использованием 5,5-ди-тио-бис (-2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) по методике Ellman G.L. с применением раствора сульфосалициловой кислоты для осаждения белка в пробах, что в отличие от использования метафосфорной или трихлоруксусной кислот исключало спонтанный переход восстановленной формы глутатиона в окисленную.

Принцип метода основан на образовании при взаимодействии ДТНБ (реактива Эллмана) с кислоторастворимыми тиоловыми группами окрашенного продукта – 5-тио, 2-нитробензойной кислоты, имеющего максимум поглощения на длине волны 412 нм.

К 0,6 мл гемолизата эритроцитов добавляли 0,2 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин при температуре +2°С. 0,2 мл полученного супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2,55 мл 0.1 М ТРИС-HCl буфера с 0,01% этилендиаминтетраацетатом рН 8,5. К полученной смеси добавляли 25 мкл раствора ДТНБ (4 мг коммерческого препарата ДТНБ фирмы «Boehringer Mannheim», Германия, в 1 мл абсолютного метанола). После развития окраски пробы фотометрировали на спектрофотометре СФ-26 против дистиллированной воды на длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Расчет содержания ВГ проводили по калибровочной кривой. Для чего из коммерческого препарата ВГ («Sigma», США) готовили растворы ВГ с концентрациями от 0,02 до 2,0 ммоль/л, из них отбирали пробы для определения содержания ВГ по описанной выше методике и по полученным значениям экстинкции строили калибровочную кривую по которой рассчитывали концентрацию ВГ и выражали в МЕ/109 эр.


Метод определения активности СОД (КФ 1.15.1.1.). Определение активности СОД проводили по методу Бергмеера Н. (1976). Регулируя концентрацию супероксидных анионов, СОД вызывает ферментативную дисмутацию О2 с образованием перекиси водорода и кислорода. Об активности СОД судили по степени ингибирования нитросинего тетрозоля в присутствии НАД-Н и феназинмета сульфата. Реактивы: фосфатный буфер рН = 7,8 0,1 М, ЭДТА (10 мМ) 100 % глицерин, фенозинмонофосфат 0,2 мг/мл, нитросиний тетрозолий 4 мг в 1,0 мл 70 % спирта, ксантин натриевая соль. Активность СОД выражали в ед/мкг Hb.

Основные показатели ПОЛ оценивали до и после стимуляции процессов пероксидации липидов. В основу метода инициации ПОЛ положена работа В.И. Куликова (1976) об усилении пероксидации в мембранах эритроцитов при комплексном воздействии витамина D2, ионов двухвалентного железа и аскорбата. Среда инициации: в качестве адекватной модели инициации ПОЛ ex vivo были использованы: аскорбат железа (10-5M FeO4 *7 H2O), аскорбиновая кислота (14 мг/10 мл фосфатного буфера рН = 7,32) и 0,5% спиртового раствора витамина D2. Витамину Д2, молекулы которого могут сами становиться растворимыми свободными радикалами, отводится роль индуктора свободно-радикальных реакций в мембране эритроцитов. К 0,25 мл трижды отмытой в физиологическом растворе суспензии эритроцитов добавляем 4,75 мл приготовленного реактива (4,69 мл фосфатного буфера рН = 7,32, 0,5 мл аскорбата, 0,05 мл сернокислого железа и 0,05 мл 0,5 % спиртового раствора витамина Д2). Инкубация в термостате при температуре 37° в течение одного часа. Определяем значение ПГЭ при длине волны 540 нм и выражаем в единицах оптической плотности (ед. опт. пл.).

Методы определения показателей углеводного обмена. Активность Г-6-ФДГ (КФ 1.1.1.49.) определяли по методу Kornberg A. et al. (1955). Принцип метода основан на ферментативной реакции переноса протонов с глюкозо-6-фосфата на НАДФ+ под воздействием Г-6-ФДГ, при этом образуется НАДФ-Н, водные растворы которого имеют максимум светопоглощения на длине волны 340 нм. По интенсивности роста экстинкции при спектрофотометрии на указанной длине волны судят об активности фермента.


Ферментативную реакцию проводили на водяной бане при температуре +37°С. В кювету вносили 3,0 мл 50 мМ ТРИС-НCl буфера рН 7,6 с 5 мМ ЭДТА, 0,1 мл 10 мМ раствора НАДФ («Merck», Германия) и 50 мкл гемолизата эритроцитов. После уравновешивания температур реакцию инициировали добавлением к исследуемой среде 0,1 мл 5 мМ раствора глюкозо-6-фосфата натрия («Boehringer Mannheim», Германия). Пробы фотометрировали на длине волны 340 нм против дистиллированной воды сразу после перемешивания содержимого и через 5 мин в кювете с длиной оптического пути 10 мм на спектрофотометре DU 650. Расчет активности проводили по разности экстинкций согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра, используя молярный коэффициент светопоглощения для образующегося НАДФ-Н на длине волны 340 нм. Активность выражали для гемолизата эритроцитов в МЕ/109 эр. или мкмоль/г Hb.

Активность ФФК (КФ 2.7.1.11) определяли по методу Бергмеера Н., 1976. Реактивы: Трис-буфер 0,1 М рН = 8,5, NaДН-Na2, фосфоенолпируат (ФЕП) М = 208,0 0,71 М, фруктоза-1,6-дифосфат, М.в. 550,2 0,64 мМ, фруктозо-6-фосфат 1,8 мМ, АТФ 1,1 мМ, пировиноградная кислота (ПВК) 20 нд/мл, лактатдегидрогеназа (ЛДТ) 17 нд/мл. Активность ФФК выражали в МЕ/109 эр. или мкмоль/г Hb.

Определение количества инсулинсодержащих эритроцитов (ИСЭ) проводили по методу, разработанному Сандуляк Л.И. (1974).


следующая страница >>