birmaga.ru
добавить свой файл

1 2 3
mymio_logo.jpg

Антифибротическое действие сурамина в поврежденных скелетных мышцах после повреждения.
Мышечные травмы, наиболее часто встречающиеся в спортивной медицине, создают сложные проблемы в травматологии. Мышечное повреждение может происходить через различные механизмы, начиная от прямой механической деформации (например, разрыв мышц, деформация или ушиб) или косвенного повреждения, связанного с ишемией и неврологической дисфункцией. Пострадавшие мышцы обычно проходят процесс дегенерации и регенерации состоящий из трех фаз. Фаза разрушения характеризуется формированием гематомы, некрозом мышечной ткани, дегенерацией, и воспалительно-клеточным ответом. Восстановительный этап включает в себя фагоцитоз поврежденных тканей, регенерацию поперечно-полосатых мышц, производство соединительнотканного рубца, и ростом капилляров. На заключительном этапе реконструкции регенерирующие мышцы созревает вместе с реорганизацией рубцовой ткани. Хотя мышечная ткань сохраняет свою способность к регенерации после травмы, процесс заживления, как правило, происходит медленно и часто не полностью. Полное восстановление скелетных мышц препятствует развитию фиброза, который обычно появляется в течение второй недели после повреждения мышц и увеличивается с течением времени. Мы создали различные животные модели мышечной травмы и наблюдали процесс регенерации в поврежденных мышцах. Долгосрочная цель нашего исследования - разработка биологических мероприятий по улучшению заживления мышц после травм. Для достижения этой цели, наша исследовательская группа исследует две основные процедуры: повышение регенерации мышц и предотвращение мышечного фиброза. Мы охарактеризовали влияния нескольких факторов роста на повышение пролиферации миобластов и синтеза в лабораторных условиях. Это привело к идентификации трех перспективных факторов роста [фактор роста нервов, основного фактора роста фибробластов, и, в частности, инсулиноподобного фактора роста (IGF) -1], которые улучшают регенерацию мышц . Тем не менее, полное восстановление пострадавших мышц продолжает быть ограничено развитием фиброза. Таким образом, мы сосредоточили наши недавние усилия на развитии биологических подходов для предотвращения фиброза мышц после травм. Перепроизводство трансформирующего фактора роста (TGF)-β в ответ на повреждение и заболевание является основной причиной фиброза тканей в организме человека и других животных. В скелетных мышцах, TGF-β1 экспрессируется на высоком уровне и связан с процессом фиброзирования в скелетных мышцах у пациентов с миодистрофией Дюшенна. Кроме того, во время мышечной травмы, воспалительные реакции, которые происходят в месте повреждения, приводят к координационному производству TGF-β1, который вызывает фиброз через активацию внеклеточного матрикса и разрастание соединительной ткани. Мы также сообщали, что TGF-β является основным фактором в запуске каскада фиброза в скелетных мышцах. Блокируя фиброзный эффект TGF-β1 с помощью инъекции биологически активных молекул- декорина, прямого антагониста TGF-β1 (51), мы обнаружили, что структура и функция мышц достигли почти полного выздоровления. Тем не менее, очень большое количество декорина эффективно улучшало заживление очень маленьких мышц мышей. Таким образом, мы сосредоточили наши усилия на выявление биологических агентов, которые могут быть использованы клинически и имеют антифиброзные эффекты, сопоставимые с декорином. Сурамин (Sigma Chemical, Сент-Луис, Миссури) был первоначально разработан в качестве противопаразитарного препарата и подавлял TGF-β путем конкурентного связывания с рецептором фактора роста. Имея это в виду, мы предположили, что сурамин также может связываться с TGF-β рецептором обычно встречающимся в клетках в месте мышечных травм и тем самым предотвращает активацию TGF-β1 и его влияние на миофибробласты. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели серию тестов в пробирке, чтобы определить влияние сурамина на фибробласты. В естественных условиях, мы выбрали модель рваной раны, чтобы подтвердить антифиброзных эффект сурамина и оценить ее влияние на мышцы.

Материалы и методы

Влияние Сурамина на фибробласты In Vitro.

Клеточные культуры NIH 3T3 клеток, известной линии фибробластов, культивировали в среде Дульбекко в модификации Игла (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 0,5% экстракта куриного эмбриона, и 1% пенициллина / стрептомицина. Все клетки были выращены при 37 ° С в 5% СО2 в течение 3 дней с периодическим изменениям среды. NIH 3T3 клетки (2.000 клеток / лунку) высевали в 12-луночные планшеты. После 12-часового инкубационного периода, среда была полностью удалена, а свежую среду роста (без сыворотки) добавляют сурамин (50 мкг / мл). Свежая среда (с той же концентрацией сурамина) добавляют каждые 2 дня. Для измерения пролиферации клеток, клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали в гемоцитометре. Пять отдельных пластин в группе на момент времени были оценены и по сравнению с контролем (без сыворотки в среде, без сурамина) через 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч инкубации.

Вестерн-блоттинг.

Для анализа влияния TGF-β1 в мышцах, липофектин (Invitrogen) использовали для трансфекции в C2C12 клетки плазмидой, кодирующей TGF-β1 и неомицин, как описано ранее. После выбора G418 (500 мкг / мл, Invitrogen), C2C12 клетки, экспрессирующие TGF-β1, были названы "CT клетки". Такое же количество (105) СТ клеток клона помещали в различные Т-25 колбы и обрабатывали сурамином в концентрации 0, 1, 10 и 50 мкг / мл. Параллельно с ростом проведены три независимые испытания. Экспрессия α-актина гладких мышц (α-SMA) и виментина, оба из которых являются маркерами миофибробластов, была оценена в этих клетках. После 72-часового периода инкубации клетки дважды промывают фосфатным буферным раствором (PBS; Roche, Indianapolis, IN) и лизировали лизат буфера [отношение β-меркаптоэтанола в буфере для образцов (62,5 мМ Tris · HCl, рН 6,8, 2% SDS, 25% глицерина) = 1:20]. После этого весь лизат клеток центрифугировали при 3000 г в течение 5 мин и супернатант собирали и хранили при 4 ° C. Образцы были проанализированы с помощью 12% SDS-полиакриламидного геля. Концентрации белка определяли с помощью методологии Брэдфорд . Четыре мкг белка из каждого образца были загружены, и разделены при 55 В в течение 1 ч и 75 В в течение 3 часов. Затем мы передали общий белок на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием 60 V. Мембраны промывали в PBS в течение 5 мин и блокировали 1% обезжиренного сухого молока и 2% лошадиной сыворотки в Triton-PBS (T-PBS, 0,01%) в течение 1 ч при комнатной температуре ( 60 циклов / мин). Первичные антитела против α-SMA (1: 1000, Sigma Chemical) были применены при комнатной температуре в течение 1 ч, во время которого блоты промывают четыре раза в T-PBS. Вторичные антитела анти-IgG мыши конъюгированные с пероксидазой хрена (1:8,000, Pierce, Rockford, IL) были применены в течение 1 ч, после чего пятна снова промывают 4 раза в T-PBS (15 мин / цикл). После чего блоты промывают, они были оценены с помощью усиленной хемилюминесценции , а положительные группы были определены с помощью рентгеновской пленки. Для оценки экспрессии виментина, тот же протокол был выполнен с помощью различных антител. Первичные антитела против виментина (1:1000, Sigma Chemical) и вторичные антитела анти-IgG козы конъюгированные с пероксидазой хрена (1:8,000, Pierce) были использованы. Рентгеновские пленки из трех независимых блотов для каждого антитела были отсканированы и оценены (версии 6.0, Empix Imaging, North Tonawanda, Нью-Йорк) путем расчета оптической плотности каждой полосы белка. Анализ изображений был выполнен в черно-белом, а сигналы изображения на линейной части были выражены в сером значении в диапазоне от 0 до 256 пикселов.


Определение биологического и физиологического эффекта Сурамина на регенерацию мышц после повреждения.

Животные модели.

Модель рваной раны была разработана на мышах (C57BL10J + / +; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) на основе ранее описанных исследованиях. Сорок четыре мыши, в среднем возрасте 8 недель и примерным весом 18-22 г, были использованы в эксперименте. Животных содержали в клетках и кормили коммерческим кормом и не ограничены в воде. Комитет по исследованию на животных утвердил протоколы исследований, используемые для этих экспериментов (протокол №. 5/01). Мыши были под наркозом, используя низкие дозы (80 мг / кг массы тела животного) пентобарбитала натрия (Anpro Pharmaceuticals, Arcadia, CA). Мышцы поврежденные хирургическим лезвием (№ 11) на 50% от их ширины и 100% от их толщины. Полидиоксанон шовный материал (PDSII 5-0, Ethicon, Somerville, NJ), 4 мм в длину, был помещен в медиальные края на каждой стороне каждой ноги. После того, как рваная рана была сделана, кожа была закрыта 4-0 черным шелком. Сурамин вводили по шовному материалу микрошприцом. Мыши были разделены на три группы на основании различных моментов времени после рваной раны (0, 7 и 14 дней). В каждый момент времени, четыре различные концентрации сурамина (0, 0,25, 1 и 2,5 мг в 20 мкл PBS) были использованы. В группе (отрицательный контроль), мышцы были повреждены , как в экспериментальных группах, но вводили только PBS. Два животных в группе были оценены гистологически. Все животные были убиты для оценки заживления и регенерации через 2 постинъекционных недели. Икроножные мышцы были изолированы и замораживали в 2-метилбутан предварительно охлаждается в жидком азоте. Регулярные гистологические и иммуногистохимические методы для оценки экспрессии виментина были использованы для оценки развития рубцовой ткани после травмы.

Оценка мышечного фиброза после лечения сурамином.

24 мыши использовали для этого эксперимента. Обе икроножные мышцы мышей повреждены. Мыши были разделены на 12 групп по 2 мыши / группа (4 мышцы / группы). Различные концентрации сурамина (0, 0,25, 1 и 2,5 мг в 20 мкл PBS) вводили в каждый момент времени (0, 7 и 14 дней). Через две недели после инъекции все животные были убиты для оценки заживления и регенерации мышц. Шестнадцать мышц в момент времени (4 мышцы / концентрация) были использованы для регулярного гистологического и иммуногистохимического окрашивания. Окрашивание коллагена и виментина проводили для выявления фиброза в поврежденной мышце, как описано ранее. Промежуточные филаменты виментина были использованы в качестве маркера рубцовой ткани в данном исследовании, поскольку он экспрессируется в соединительной ткани. Виментин экспрессируется в мышечных волокнах на ранних стадиях развития, и вскоре после травмы (<2 недели), однако, зрелые мышечные волокна не выражают этого белка. Короче говоря, для окрашивания коллагена срезы фиксировали в 10% формалине в течение 10 мин. После чего срезы промывали в деионизированной воде, трехцветная изменение окраски было выполнено в соответствии с протоколом производителя (IMEB, Сан-Маркос, Калифорния). Иммуногистохимия виментина была выполнена с фиксацией секций, как описано выше. После 45 минут блокировки в 5% лошадиной сыворотке (Vector, Burlingame, CA), эти слайды инкубировали с анти-виментин сопряженными Cy3 (1:500, Sigma Chemical). Площадь поверхности фиброза в различных группах была измерена с помощью ранее описанной методике. Эти измерения были получены независимым исследователем, который не знал, какие группы лечили или использовались как элементы контроля , обеспечивая тем самым объективность результатов. Для измерения общего виментина или коллагена использовали флуоресцентный микроскоп, 10 случайных полей были выбраны для каждого образца. Изображения были собраны с помощью Olympus эпифлуоресцентного микроскопа (Olympus Optical, Токио, Япония) и Sony 970 3 (Sony, Токио, Япония). После того как они были оцифрованы с помощью Coreco Imaging (Coreco, Сен-Лоран, Квебек, Канада) и доводится до монохромного цвета, характеристики были извлечены, и абсолютные области с виментина-положительным окрашиванием измерялась в каждом поле изображения. mymio_logo.jpg


Оценка восстановления мышц после терапии сурамином.

Гематоксилин и эозин были использованы для мониторинга числа регенерирующих мышечных волокон в поврежденных областях, обработанных сурамином (0, 0,25, 1 или 2,5 мг в 20 мкл PBS), и результаты были сопоставлены между различными группами. Клетки с центрально расположенными ядрами считаются регенерирующими мышечными волокнами. Ядра без какой-либо заметной окружающей цитоплазмы были отброшены. Независимый наблюдатель осуществлял подсчет. Общее количество регенерирующих мышечных волокон в месте повреждения оценено количественно, используя пять случайных полей, выбранных из каждого образца в соответствии с ранее описанным протоколом.

Физиологическая оценка сократительных свойств мышц после терапии сурамином.

Двадцать четыре мыши были использованы для физиологических испытаний, которые были основаны на ранее описанных протоколах. Икроножные мышцы левой ноги у каждой мыши повреждены, как описано выше, и в них вводят сурамин через 14 дней после травмы. Икроножная мышца правой ноги у каждой мыши была извлечена и сохранены. Шесть мышей в каждой группе [вводили 0 (контроль), 0,25, 1 или 2,5 мг сурамина в 20 мкл PBS] были подвергнуты физиологическому тестированию для определения восстановления функций через 14 дней после инъекции. Мыши были под наркозом, используя низкие дозы (80 мг / кг массы тела животного) пентобарбитала натрия при внутрибрюшинном введении. Обе икроножные мышцы были извлечены и смонтированы в двойной оболочке в ванночку из 5 мл при 36 ° C в раствор Кребса (в мм: 113 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 CaCl2, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,5 глюкоза) и постоянно перемешивают с смесью из 95% кислорода и 5% углекислого газа. Время между извлечением мышцы и началом измерения силы была <1 мин для всех мышц. Начальная напряженность была установлена ​​на уровне 20 мН; изометрические сокращения измеряли с помощью тензометрических преобразователей в сочетании с TBM4 тензометрическим усилителем (инструменты Всемирного Precision, Сарасота, Флорида) и записан на компьютере с помощью программы сбора данных (Windaq, DATAQ инструменты , Акрон, Огайо). Частота дискретизации на канал была установлена на уровне 500 Гц. Амплитуда стимуляции сокращений была вычислена по расчету программы (WindaqEx, DATAQ). Через 20 мин мышцы выведены из равновесия электрическим стимулом через два платиновых электрода, расположенных на верхнем и нижнем концах ванны (разделенных на 4 см). Мышцы были стимулированы импульсом длительностью по 0,25 мс с максимальным напряжением (50 В). Во-первых, стимуляция в 1-Гц была использована, и сокращения мышц записаны. Тетаническое раздражение затем было применено с 0,5-с продолжительностью в 100 Гц каждые 10 с. Наконец, каждая мышца была взвешена с помощью микровесов (Mettler Toledo, Greifensee, Швейцария). Измерения напряженности были записаны и выражается в мг-ньютонов на грамм.


Статистический анализ.

Различия в пролиферации клеток между контрольной группой и экспериментальными группами, обработанными сурамином (50 мкг / мл) были проанализированы с помощью Стьюдент-теста. Статистическое сравнение фиброзных площадей, количества регенерирующих мышечных волокон, и силы в различных группах проводились при помощи анализа ANOVA. Различия между группами были проанализированы с помощью Bonferroni (должность специального теста). Статистическая значимость определяется как P <0,05.
Результаты

Влияние Сурамина на фибробластах In Vitro

Антипролиферативное влияние сурамина на пролиферацию фибробластов NIH ​​3T3 описано на рис. 1. После инкубации в диапазоне от 72 ч до 144 ч, в экспериментальной группе получавших сурамин (50 мкг / мл) наблюдалось значительное снижение числа фибробластов по сравнению с контрольной группой (без сыворотки среде без сурамина). mymio_logo.jpg



Влияние сурамина на внутриклеточные α-SMA и виментин, Вестерн-блот анализ.

Чтобы оценить насколько сурамин влияет на α-SMA и виментин, мы исследовали влияние сурамина на содержание белка в клетках. Чтобы убедиться в том, что клетки реагируют на сурамин, темп роста был определен. После 72 ч инкубации с сурамином (50 мкг / мл), один набор клеток подсчитывали, чтобы подтвердить, что рост NIH 3T3 фибробластов подавляется значительно. Вестерн-блот анализ показал снижение экспрессии внутриклеточных α-SMA и виментина при концентрации сурамина 50 мкг / мл. Денситометрическая оценка показала 100% снижение α-SMA и виментина в клетках, которые инкубировали с 50 мкг / мл сурамина, 73 и 81% снижение соответствующих белков при концентрации 10 мкг / мл сурамина , и снижение 53 и 45% соответствующих белков при 1 мкг / мл сурамина по сравнению с контролем (0 мкг / мл сурамина) (таблицы 1 и 2).


Определение биологического и физиологические эффекты Сурамина на регенерацию мыш после повреждения.

Оценка мышечного фиброза после инъекции сурамина .

Гистологическая оценка в сочетании с количественным анализом коллагена и виментина на поврежденном участке дает предположение , что введение высоких концентраций сурамина (2,5 мг в 20 мкл PBS) более эффективно предотвращает фиброз, чем введение более низких концентрациях сурамина (1, 0,25 и 0 мг; рис. 2, 3, 4, 5).. Значительно меньше рубцовой ткани образуется в экспериментальной группе, получавшей 2,5 мг сурамина, чем в контрольной группе (P <0,05).Тормозящее действие сурамина на развитие фиброза мышц, казалось, зависит от дозы, однако, значительное снижение фиброза наблюдается при дозах от 1,0 и 2,5 мг сурамина (указано содержание виментина и коллагена), никаких существенных различий в результатах не было обнаружено между 0,25-и 1-мг и 1 - и 2,5-мг. Процент рубцовой ткани через 4 недели после травмы колебался от ~ 12,8% от общей площади в контрольной (0 мг сурамина) до 7,9% в 0,25-мг группе, 4,7% в 1-мг и 2,6% в 2,5-мг.



следующая страница >>