birmaga.ru
добавить свой файл

1
Стадия 1: Выделение ДНК


1. Cвежие клетки диатомей промыть 3.5 % раствором NaC1 и быстро

заморозить на -80° C.

2. Оттаять до комнатной температуры и ресуспендировать в буфере 1

(20 mM TRIS-HC1, pH 8.0, 100 mM NaC1, 50 mm Na2EDTA) из расчёта 4.5 мл

буфера на 1-2 г. клеток.

3. Добавить 250 мкл 20% SDS, перемешать.

4. Добавить 250 мкл 10 mg/ml протеиназы K, перемешать.

5. Инкубировать 45 мин при 50°C.

6. Добавить 250 мкл 10 mg/ml протеиназы K, перемешать.

7. Экстрагировать дважды с 8 мл фенола (Helicon, phenol

water-saturated)

8. Центрифугировать 10 мин, 20°C, 16 500 g (Sorvall HB-4 rotor).

9. Добавить 1/10 объёма 3М ацетата натрия (pH 5.2)

10. Добавить два объёма этанола

11. Центрифугировать 15 мин, 20°C, 16 500 g (Sorvall HB-4 rotor).

12. Промыть дважды 70% этанолом

13. Центрифугировать 15 мин, 20°C, 16 500 g (Sorvall HB-4 rotor).

14. Высушить осадок вакуумной сушкой.
Стадия 2: Очистка ДНК

1. Добавить к сухому осадку 490 мкл ТЕ буфера, 15 мкл 20% SDS, 3 мкл

РНКазы (20 мкг/мл)

2. Инкубировать 1 час при 37°C

3. Добавить 3 мкл протеиназы K (20 мкг/мл)

4. Инкубировать 1 час при 37°C

5. Добавить 100 мкл 5М NaC1, перемешать

6. Добавить 160 мкл 50% буфера СТАВ/ NaC1 – (5% СТАВ, 0,35M NaC1)

7. Инкубировать 15 min - 65°C.

8. Добавить равный объём хлороформа

9. Центрифугировать 5 мин, 12000 rpm

10. Переместить верхнюю водную фазу в новую пробирку

11. Добавить один объём смеси фенолхлороформа (1:1)

12. Центрифугировать 5 мин

13. Перенести верхнюю фазу в чистую пробирку

14. Добавить 2 объёма 96% этанола

15. Дважды промыть 70% этанолом

16. Удалить супернатант, просушить

17. Растворить осадок в 1X ТЕ буфере