birmaga.ru
добавить свой файл

1 2 3
К вопросу об истории онкологических показаний


экстрактов омелы белой ХЕЛИКСОР в инъекциях

(по материалам книги «Омела белая в онкологии»

немецких авторов Н.Кинле и А.Кине).
Ролик И.С., Завадская А.И.

Кафедра гомеопатии РУДН (г.Москва).

Продолжение

(начало в №1 за 2005 г.)

Лектины омелы белой.
Лектины омелы белой и, прежде всего, лектин MLI на сегодняшний день представляют собой самый известный и наиболее изученный класс веществ, содержащихся в омеле белой. Лектины (от лат. legere – выбирать) - гликопротеины, характерной особенностью которых является способность агглютинировать клетки и высокоспецифически распознавать и связывать определенные сахара, однако при этом они не проявляют по отношению к этим сахарам никакого ферментативного действия и не являются иммуноглобулинами.

Отдельные лектины определяются по тому или иному сахару, который они связывают. В природе, особенно в растениях, лектины широко распространены. Они были обнаружены два века назад и с тех пор вызывают огромный интерес у ученых. В растениях они, по-видимому, кроме всего прочего, защищают от инфекций, стрессовых воздействий окружающей среды, а также от повреждений, вызванных холодом.

Большое значение лектины приобрели в биомедицинских исследованиях. Старейшей областью их применения является серология групп крови. Сегодня их используют и для других целей. Так, способность к селективному распознаванию определенных структур сахаров используется в качестве подтверждения наличия сахаросодержащих макромолекул, что может быть использовано во многих областях; другая сфера применения основывается на классической особенности некоторых лектинов к митогенной стимуляции: они побуждают покоящиеся лимфоциты к интенсивной пролиферации, что используется для диагностических целей в иммунологии и современной цитогенетике.

В изучении опухолей лектины также приобрели большое значение в различных аспектах: с одной стороны, в диагностических и терапевтических целях хотят использовать их способность специфически распознавать структуру сахаров, с другой - их противоопухолевое и иммуномодулирующее действие, которое обнаруживают in vitro и in vivo некоторые растительные лектины (среди которых, также лектины омелы белой).


Уже в 1956 году I.Kruepe описал агглютинирующие особенности омелы белой (цит. по Kienle N., Kiene A., 2003). Опираясь на данные опытов по агглютинации, P.Luther и H.Becker (1987) предположили, что омела белая содержит лектиноподобные компоненты, которые связываются с галактозидными структурами и с помощью хромотографии выделили эти «субстанции, подобные антителам» и назвали их «лектинами омелы белой». Затем в 70-е и в начале 80-х годов H.Franz, P.Ziska и P.Luther изолировали три лектина омелы белой и назвали их «ML I, ML II, ML III» (Kienle N., Kiene A., 2003).

Изучением лектинов омелы белой занимались и другие исследователи. R.Samtleben et al. (1985) называли их «агглютининами омелы белой I и II» (Viscum Album Agglutinin I, II - VAA I, II), а S.Olsnes et al. (1982) - вискуминами («Viscumin»). Имелся в виду лектин ML I омелы белой.

На Украине M.D.Lutsik в 1975 году изолировал лектин и назвал его «омелотоксин» (от названия растения – омела) (цит. по H.Franz, 1989; Lutsik M.D., Panasiuk E.N., Lutsik A.D., 1981; Lutsik M.D., Lutsik A.D. et al., 1977). В этом случае речь шла о лектине ML I.

ML I связывается специфически с D-галактозой, ML III с N-ацетил-D-галактозамином, a ML II с обоими сахарами. Как мономеры, лектины имеют молекулярную массу 50 000 - 63 000 Da (табл. 1), однако они могут, чаще всего ML I, присутствовать в качестве димеров или даже тримеров. Мономеры состоят из двух цепочек: токсической А- и сахаросвязывающей В-цепочки, которые соединяются в лектине омелы белой посредством дисульфидного мостика. Лектины состоят из множества изолектинов, спектр которых может существенно различаться в разных растительных экстрактах, что влияет на их биологические характеристики. Существуют структурные сходства с рицином (лектином клещевины Ricinus communis) и абрином (лектином из абруса Abrus precatorus) (Lutsik M.D., Lutsik A.D. et al., 1977).

Таблица 1. Лектины (гликопротеины) омелы белой (Pfüller G. et al., 2001).



Лектины

Сахара, как составная часть лектинов

Происхождение

Молекулярная масса, Da

ML I

D-галактоза

Омела из лиственных растений

115 000 (димер). А-цепь 29 000

63 000. B-цепь 34 000

ML I-1

D-галактоза

Берёзовая омела

65 000

ML I-2

D-галактоза

Берёзовая омела

67 000

ML II

D-галактоза / N-ацетил-D-галактозамин

Омела из лиственных растений

63 900

ML III

N-ацетил-D-галактозамин

Сосновая омела

61 600

rML

D-галактоза

Рекомбинантный лектин из E.coli

58 400


Лектины в целом составляют лишь очень небольшую часть - приблизительно 1% протеинов омелы белой. Содержание лектинов в омеле белой колеблется в зависимости от дерева-хозяина, времени года, зимней температуры, причем зимой, особенно холодной, их количество в омеле белой значительно выше.

В экстракте омелы белой лектины и другие составные компоненты, такие как полисахариды, протеины, везикулы, составные элементы мембраны и нуклеиновые кислоты, предположительно образуют комплексы, однако, судя по всему, биологическая активность лектинов при этом не уменьшается. Возможное значение подобного взаимодействия (между лектинами и полисахаридами) заключается в стабилизации лектинов.


Из омелы белой были также выделены и другие лектины, названные VisalbCBA и cbML (chitin-binding mistletoe lectin), так называемые хитинсвязывающие лектины, которые существенно отличаются от трех известных лектинов омелы белой ML I, II и III и не относятся к 2-рибосомо-инактивирующим протеинам. Их содержание значительно варьирует, но особенно высоко в яблоневой и тополевой омеле.

VisalbCBA является димером с двумя идентичными субъединицами, каждая из которых обладает молекулярным весом приблизительно 10 000 Dа, т.е. существенно меньшим, чем вес других известных лектинов омелы белой. Он связывается специфически с N-Ацетилглюкозамином и серологически не имеет родственных связей с другими лектинами омелы белой. VisalbCBA воздействует также цитостатически на клетки Molt-4, однако является менее токсичным, чем ML I, II, III. Интересно, что совместное выделение ML I и VisalbCBA сокращает цитотоксичность ML I на клетки Molt-4, что может быть следствием связывания VisalbCBA и ML I. Участие этого лектина (VisalbCBA) в биологическом и иммуномодулирующем действии омелы белой возможно, но еще до конца не изучено.

Между тем ген омелы белой был клонирован и в настоящее время производится рекомбинантный ML I, который проходит биологические испытания. Рекомбинантный ML I является, в отличие от лектинов омелы естественного происхождения, не глюкозилированным, что влечет за собой изменение определенных биохимических характеристик, однако создается впечатление, что их цитотоксичность, инактивация рибосом и способность индуцировать цитокины сравнимы. В то же время, для индукции цитокинов или для достижения противоопухолевой эффективности требуются намного большие дозировки рекомбинантного ML I, чем при использовании ML I естественного происхождения.

Аналитическое определение лектинов осуществляют в экстрактах омелы белой 2 методами (Kienle N., Kiene A., 2003).

В методе ELLA (enzyme-linked lectin assay) лектины определяются по их сахаросвязующим свойствам с сахаросодержащим лигандом галактозой (N-ацетил-глактозамином). При этом также используются специфические фермент-маркированные антитела, которые связываются с фиксированными лектинами омелы белой. Этот комплекс обнаруживается посредством ферментных реакций и таким образом определяется содержание лектина. Метод имеет различные ограничения: так определяются только активные, т.е. сахаросвязывающие лектины, которые еще не связались, например, с углеводами экстракта. Таким образом, результат может меняться в зависимости от сахаров, входящих в состав экстракта. Кроме того, N-ацетил-галактозамин может связать не только ML I, но и ML II или ML III, так что в зависимости от использованного сахара с помощью этого теста дифференцировать лектины омелы белой невозможно.


В методе ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) лектины омелы белой определяются по их антигенным свойствам. Вначале их связывают с фиксированными специфическими антителами, после чего добавляется другое, связанное с ферментом антитело, которое после соединения с лектинами омелы обнаруживается посредством цветовой реакции. Так как антитела не только соединяются с сахаросвязующими эпитопами лектинов, то таким образом можно определить и несахаросвязующие лектины – т.е. неактивные лектины или их фрагменты. В общем, метод ELISA считается – в зависимости от специфичности и химического родства используемых антител – наиболее чувствительным и специфическим методом анализа лектинов.

При этом надо понимать, что иммунохимическое определение и стандартизация содержания лектинов не позволяет делать никаких выводов об их биологической активности, так как при равном содержании лектинов дивергирующие образцы изолектинов могут привести к различным биологическим влияниям на клетку. И это является не последней причиной того, что были разработаны биометоды для измерения биологической активности лектинов омелы белой, например, основываясь на их цитотоксичности (лейкозные клетки Molt-4) или их иммуномодулирующей потенции (освобождение IL-1α и IL-6 в анализе Skin2-Assay).

Следует отметить, что результаты количественных определений лектинов омелы белой, которые получены посредством различных тестов или ML-стандартов, нельзя сравнивать между собой, поскольку на них оказывают влияние различия по другим биологически активным веществам в составах экстрактов (Kienle N., Kiene A., 2003).
Цитотоксичность лектинов омелы белой.
Обнаружено цитотоксическое действие лектинов омелы белой на опухолевые и другие клетки. Начиная с 70-х годов, противоопухолевое действие лектинов омелы белой было изучено во множестве экспериментов. Уже вскоре выяснилось, что лектины оказывают влияние на опухоли как минимум двумя способами:

- прямым - путём непосредственного повреждения клеток опухоли,


- непрямым - посредством стимуляции иммунологических процессов.

С тех пор это свойство изучалось по разным направлениям: в отношении различных линий опухолевых клеток, в отношении значения лектинов в цитотоксичности всего экстракта в целом и, что особенно важно, в отношении цитобиологических механизмов реализации этой цитотоксичности. Вывод был следующим: цитотоксичность лектинов омелы белой проявляется уже в очень малых дозировках, измеряемых пикограммами; при этом чувствительность различных клеточных линий заметно варьирует.

Прямая цитотоксичность лектинов базируется на нескольких клеточных механизмах, прежде всего на замедлении синтеза протеинов и на индукции программируемой клеточной гибели - апоптозе. Давно известно, что в значительной мере цитотоксичность экстрактов омелы белой объясняется лектинами, по крайней мере, в отношении некоторых клеточных линий. Однако наряду с лектинами экстракт омелы белой содержит другие субстанции, которые также оказывают существенное влияние на цитотоксичность экстракта в зависимости от той или иной клеточной линии. Затем выявилось, что все три лектина (а не только лектин ML I омелы белой), находящиеся на сегодняшний день в центре внимания, могут быть цитотоксичными для клеток опухоли. Причем их относительная цитотоксическая активность зависит от клеточной линии и, предположительно, от способа культивации.

Замедление синтеза протеинов и индукция апоптоза опухолевых клеток. Существует множество исследований цитобиологических механизмов действия, которые лежат в основе цитотоксичности лектинов омелы белой. Хорошо изучены два из них.

ML I замедляет синтез протеинов клеток, как в бесклеточной системе (лизат ретикулоцитов кролика), так и в интактных клетках (клетки BL8L). При таком замедлении синтеза протеинов А-цепочка лектина ML I каталитически инактивирует субъединицу рибосом 60S, необратимо расщепляя при этом рибосомную РНК в точке A4324. Благодаря способности специфической инактивации рибосом (вследствие активности р-РНК-N-гликозидазы) лектин омелы белой причисляют к «рибосомоинактивирующим протеинам типа 2», сокращенно «Typ 2 RIPs» (тип 2, т.к. в нем 2 цепочки), к которым также относят и широко известный токсичный рицин или абрин.


То, что лектины Typ 2 RIPs являются очень токсичными, нашло отражение даже в истории криминалистики. В 1978 болгарский журналист и политический критик Георгий Марков был убит на одном из лондонских перекрестков. По предположению Скотланд-Ярда преступник сделал ему укол микроскопической дозы рицина в ногу при помощи специально оборудованного зонтика (Kienle N., Kiene A., 2003, стр. 22).

Как отмечал H.Franz (1986), для иллюстрации цитотоксического действия лектинов омелы белой путем замедления синтеза протеинов можно принять следующую модель: цепочка В связывается с рецептором поверхности клетки, содержащим D-галактозу или N-ацетил-D-галактозамин, таким образом посредством эндоцитоза соединенный с рецепторами токсин попадает в клетку; необходимым условием для этого является наличие Ca2+. После расщепления на цепочки А и В цепочка А необратимо ингибирует синтез протеина путем разрушения рибосомной рРНК. Для реализации такого механизма цитотоксичности необходимы как исходный лектин омелы белой, так и связывание с рецепторами поверхности клетки цепочки В, при этом изолированные цепочки не проявляют никакого эффекта. Опираясь на свои опыты, H.Franz пришел к заключению, что «…лектины омелы белой принадлежат к наиболее биологически активным протеинам» (Franz H., 1986). Так как механизм цитотоксичности ML I полностью отличается от такового у других компонентов омелы белой, следовало бы предположить, считал Franz, что экстракты омелы белой атакуют клетки опухоли своими различными составляющими с нескольких сторон.

Лектины омелы белой могут не только необратимо блокировать рРНК, но также и индуцировать апоптоз – программируемую клеточную гибель в клетках опухоли, лейкозных клетках, лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах. Несмотря на попытки детально проанализировать клеточный механизм, посредством которого лектины омелы белой индуцируют апоптоз, в целом он еще не изучен. Программа самоуничтожения запускается лектинами даже в низкой концентрации. Предположительно при этом также играет роль индукция цитокинов. Связывание лектинов с клеткой в течение нескольких минут приводит к быстрому увеличению концентрации внутриклеточного кальция, изменению проницаемости клеточной мембраны, повышению уровня свободных кислородных радикалов, снижению функции p53 и bcl-2, экспрессии митохондриальных молекул Apo2.7, перемещению фосфатидилсерина к внешнему слою клеточной мембраны и, затем, к индукции IL-4, частично IL-6 и TGFβ, а позднее к фрагментации ДНК.


Исследования показывают (Büssing A. et al., 1997), что апоптоз индуцируется независимо от наличия рецепторов апоптоза, при этом гораздо большее значение имеют митохондриальные, рецепторонезависимые сигнальные пути (например, цитохром c/Apaf-1), и что активация каскада каспаз является существенным компонентом сигнального пути (каспаза-3 и -9, менее -8). В выживших клетках ML III индуцировал теломер-ассоциации и С-анафазу, что указывает на потерю теломеров и может привести к хромосомной нестабильности - это также может индуцировать апоптоз.

Предметом дискуссии стало взаимодействие лектинов омелы белой с ДНК как причиной индукции апоптоза. Предположительно лектины омелы белой могут косвенно индуцировать апоптоз, повышая экспрессию Fas-лиганд в лимфоцитах, и таким образом они способствуют тому, что в клетках Fas+, например клетках опухоли, запускается программа самоуничтожения.



следующая страница >>