birmaga.ru
добавить свой файл

1
КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ИММУННОГО СТАТУСА И ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ ПОСЛЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

П.Ф. Забродский, Е.В. Стрельцова


Широкое использование фосфорорганических соединений (ФОС) в сельском хозяйстве и быту может приводить к загрязнению окружающей среды, вызывать острые, подострые и хронические интоксикации [1,2,14]. Отравления могут вызывать также ФОС и различные антихолинэстеразные соединения (обладающие практически такой же токсикодинамикой, как ФОС), используемые в медицине. Кроме того, в настоящее время химическое оружие (ХО) на основе ФОС (российского VX, зарина, зомана) уничтожаются согласно Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения ХО и его уничтожении [2,4]. При этом не исключена возможность возникновения аварийных ситуаций в процессе уничтожения ХО, в частности, ФОС, которые могут приводить заражению почвы, воздуха, воды, приводить к поражению персонала химических объектов и населения прилегающих территорий. Существует вероятность использования ФОС в террористических и криминальных целях [4,12].

В последнее время за рубежом активно ведутся разработки высокоэффективных антидотных средств при поражении ФОС [7,11,13], анализируются их отдаленные эффекты [12].

Нарушения функции иммунной системы, в частности, Th1- и Th2-лимфоцитов и синтеза Т-клетками и другими клетками крови цитокинов при хроническом отравлении ФОС практически не исследованы [2]. Существует необходимость оценки влияния хронической интоксикации ФОС на иммунные реакции и продукцию Th1- и Th2-лимфоцитами цитокинов с целью и возможности фармакологической коррекции постинтоксикационных нарушений иммунного гомеостаза [1,2] .

Данные литературы позволяют предполагать, что применение имунофана (гексапептид с молекулярной массой 836 Да - аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин, синтетическое производное тимопоэтина) способно обеспечить восстановление показателей системы иммунитета после хронической интоксикации отравления ФОС [2,3].

Целью исследования являлась оценка хронического действия ФОС (зарина и метилпаратиона) на иммунные реакции, содержание цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 в крови и исследование возможности фармакологической коррекции нарушений применением имунофана.

Опыты проводили на беспородных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. ФОС - зарин (НИЛ Саратовского военного института биологической и химической безопасности), метилпаратион (Sigma-Aldrich) – вводили подкожно ежедневно в течение 30 сут в дозе 0,03 DL50. (DL50 зарина и метилпаратиона при подкожном введении составляли соответственно 0,018+0,004 и 0,24+0,02 и мг/кг). Имунофан вводили внутримышечно в течение 5 сут в дозе 20 мкг/кг (ежедневно, однократно) на 26 сут после первого введения ФОС. Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [2,5] после хронической интоксикации ФОС через 30 сут после первой инъекции антихолинэстеразных веществ. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции плазматическими клетками IgM, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции IgM), которую проводили внутрибрюшинно в дозе 2·108 на 26 сут после первого введения ФОС. Функцию Th1-лимфоцитов оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5·108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после иммунизации, которую проводили внутрибрюшинно на 26 сут после первого введения ФОС. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию Th2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие IgG к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (на 14 сут после иммунизации) методом непрямого локального гемолиза в геле [5]. При этом крыс иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2·108 клеток на 17 сут после первого введения ФОВ. Таким образом, при оценке всех иммунных реакций животные получали суммарную дозу ФОС, составляющую 0,9 DL50.

Концентрацию цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 исследовали в плазме крови крыс через 30 сут после первой инъекции ФОС методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. При этом ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли через 4 сут после иммунизации ЭБ, а ИЛ-4 - на 14 сут. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.

После хронической интоксикации зарином и метилпаратионом (табл. 1) через 30 сут происходило снижение гуморального иммунного ответа к Т-зависимому антигену (по числу АОК к ЭБ в селезенке через 4 сут после иммунизации), характеризующему функцию Th1-лимфоцитов и синтез IgM, по сравнению с контрольным уровнем соответственно в 2,02 и 2,35 раза (p<0,05).

После хронической интоксикации зарином и метилпаратионом отмечалась также существенная редукция активности Th1-лимфоцитов, оцениваемая по реакции ГЗТ, соответственно в 1,97 и 2,16 раза (p<0,05). Через 30 сут после интоксикации зарином и метилпаратионом отмечалась супрессия продукции IgG (по числу АОК в селезенке на 14 сут после иммунизации ЭБ), отражающая преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, соответственно в 1,60 и 1,48 раза (p<0,05).

Параметры, характеризующие клеточную и гуморальную иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, после хронического воздействия ФОС в среднем снижались соответственно в 2,13 и 1,54 раза. Это свидетельствует о том, что под влиянием ФОС в большей степени поражается функция Th1-лимфоцитов.

Таблица 1

Влияние имунофана на функцию Th1- и Th2- лимфоцитов белых крыс после хронической интоксикации ФОС (суммарная доза 0,9 DL50, 30 сут), пг/мл (М+m, n = 9-12)




Серия опытов



Функция Th1-лимфоцитов

Функция Th2-лимфоцитов

АОК к ЭБ (IgM), 103 ­­­

ГЗТ, %

АОК к ЭБ (IgG), 103

Контроль

47,1+4,3

37,9+3,5

55,2+5,6

Зарин

23,3+2,8*

19,2+2,0*

34,5+3,6*

Метилпаратион

20,0+2,4*

17,1+1,9*

37,4+4,6*

Зарин+имунофан

39,1+3,7

32,2+3,1

43,0+4,4

Метиопаратион +имунофан

41,9+3,8

29,9+3,0

46,7+4,8

Примечание. * - p<0,05 по сравнению с контролем.

Имунофан частично восстанавливал иммунные реакции, характеризующие функцию функцию Th1- и Th2- лимфоцитов. При этом данные параметры несущественно отличались от контрольных значений (p>0,05).

Полученные данные в отношении большей редукции активности Th1-лимфоцитов по сравнению с Th2-лимфоцитами после хронической интоксикации ФОС, подтверждается оценкой концентрации цитокинов в крови крыс (табл. 2). После интоксикации зарином и метилпаратионом через 30 сут выявлено уменьшение концентрации ИФН-γ (на 5 сут после иммунизации ЭБ) в 2,46 и 2,28 раза (p<0,05), а ИЛ-4 (на 14 сут после иммунизации ЭБ) - в 1,52 и 1,81 раза (p<0,05) соответственно. Это свидетельствуют о том, что по сравнению с ИЛ-4 концентрация ИФН-γ в крови под влиянием ФОС снижается в большей степени.

Таблица 2

Влияние имунофана на содержание цитокинов в плазме крови крыс после хронической интоксикации ФОС (суммарная доза 0,9 DL50, 30 сут), пг/мл (М+m, n =7)


Серии опытов

ИФН-γ

ИЛ-4

ИФНγ/ИЛ-4

Контроль

1210+102

123+11

9,8

Зарин

492+51*

81+6*

6,0

Метилпаратион

530+60*

68+7*

7,8

Зарин+имунофан

989+97

109+9

9,1

Метилпаратион +имунофан

1108+99

117+10

9,5

Примечание. * -p<0,05 по сравнению с контролем.

Уменьшение соотношения ИФН-γ/ИЛ-4 характеризует большее снижение функциональной активности лимфоцитов Th1-типа по сравнению с функцией Th2-клеток [5,6]. Так, установлено, что при действии зарина и метилпаратиона соотношение ИФН-γ/ИЛ-4 было существенно ниже контрольного уровня равного 9,8 и составляло в среднем 6,9.

Вероятно, данный эффект обусловлен способностью ФОС активировать гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему, увеличивая в крови концентрацию кортикостерона [2]. При этом известно, что данный гормон в большей степени снижает функцию лимфоцитов Th1-типа по сравнению с Th2-лимфоцитами [5]. Возможно также, что ФОС способны ингибировать в большей степени ацетилхолинэстеразу (АХЭ) на клеточной мембране лимфоцитов Th1-типа, а также большей ролью АХЭ в реализации функций лимфоцитов Th1-типа [2].

Полученные данные позволяют полагать, что относительное увеличение активности Th2-лимфоцитов по сравнению с функцией Th1-клеток после отравления ФОС может приводить к увеличению вероятности вирусных инфекций (по сравнению с микробными) [8].

Применение имунофана частично восстанавливало содержание ИФН-γ, ИЛ-4 и соотношение ИФН-γ/ИЛ-4 до контрольных уровней. При этом данные параметры отличались от контроля статистически незначимо (p>0,05).

При исследовании концентрации в плазме крови крыс цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 (табл. 3) установлено уменьшение их содержания через 30 сут после хронического действия зарина соответственно в 1,90; 1,75 и 1,41 раза (p<0,05), а при действии метилпаратиона – в 1,77; 2,07 и 1,56 раза (p<0,05).

Уменьшение в крови под влиянием ФОС ИЛ-2 свидетельствует о снижении его синтеза Т-лимфоцитами (как CD4+, относящимися к лимфоцитам Th0- типа), так и некоторыми CD8+, супрессии пролиферации Т- и В-клеток (синтеза J-цепи молекулы иммуноглобулина), активности естественных клеток-киллеров (ЕКК) [5,9].

Таблица 3

Влияние имунофана на содержание цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 в плазме крови крыс после хронической интоксикации ФОС (суммарная доза 0,9 DL50, 30 сут), пг/мл (М+m, n =7)


Серии опытов

ИЛ-2

ИЛ-6

ИЛ-10

Контроль

1342+105

91±11

530±51

Зарин

705+80*

52±5*

377±41*

Метилпаратион

758+81*

44±5*

340±36*

Зарин+имунофан

1130+98

79±8

476±45

Метилпаратион +имунофан

1092+103

87±9

505±54

Примечание. * -p<0,05 по сравнению с контролем.

Снижение в крови провоспалительного цитокина ИЛ-6 (в определенных условиях этот цитокин проявляет и антивоспалительные свойства) характеризует уменьшение его синтеза макрофагами и лимфоидными дендритными клетками вследствие их поражения ФОС [5,9].

Содержание в крови антивоспалительного цитокина ИЛ-10, продуцируемого Th0-, Th2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками и снижающего секрецию ИФН-γ Th1-лимфоцитами [9,10] уменьшалось после хронической интоксикации ФОС. Супрессия синтеза ИЛ-10 в меньшей степени, чем ИФН-γ, подтверждает установленный нами больший поражающий эффект ФОС в отношении Th1-лимфоцитов. Относительно небольшая редукция ИЛ-10, вероятно, связана со значительным снижением ФОС синтеза ИФН-γ. При этом не реализуется эффект ИЛ-10, продуцируемого Th0-, Th2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками, который способен усилить супрессию функции Th1-лимфоцитов и синтез ими ИФН-γ в еще большей степени [9].

Имунофан частично восстанавливал содержание интерлейкинов в крови вследствие его иммуностимулирующего действия на все звенья системы иммунитета, а также в результате его детоксицирующего, гепатопротективного и антиоксидантного эффектов [1]. Известно, что антиоксидантное действие имунофана предотвращает повреждение ДНК лимфоцитов и гранулоцитов, вызванное химическими факторами окружающей среды (токсикантами) [3].


ВЫВОДЫ

1. Хроническое действие ФОС (зарина и метилпаратиона) в течение 30 сут в суммарной в дозе, составляющей 0,9 DL50 (по 0,03 DL50 ежесуточно), в большей степени снижает иммунные реакции, связанные с функцией Th1-лимфоцитов по сравнению с иммунным ответом, обусловленным активацией Th2-клеток.

2. После хронического воздействия ФОС концентрация в крови ИФН-γ, продуцируемого Th1-лимфоцитами, снижается в большей степени, чем содержание ИЛ-4, синтезируемого Th2-клетками.

3. Хроническая интоксикация ФОС снижает концентрацию в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10.

4. Применение имунофана (20 мкг/кг в течение 5 сут, ежедневно, однократно) частично восстанавливает иммунный статус и содержание цитокинов в крови.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


  1. Забродский П.Ф. Влияние ксенобиотиков на иммунный гомеостаз // Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова. М.: Медицина, 2002. С. 352-384.

  2. Забродский, П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков: Монография. Саратов: СВИБХБ, 2007. 420 с.

  3. Караулов А.В. Ликов В.Ф., Евстигнеева И.В., Кокушков Д.В. Оценка различных методов иммуномониторинга при проведении иммунокоррекции // Аллергология и иммунология. 2005. Т.6, № 2. С. 136-137.

  4. Петров А.Н., Софронов Г.А., Нечипоренко С.П., Сомин И.Н. Антидоты фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. Хим. об-ва им Д.И. Менделева). 2004. Т. XLVIII, № 2. С.110-116.

  5. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир, 2000. 582 с.

  6. Сухих Г.Т., Касабулатов Н.М., Ванько Л.В. и др. Соотношение Тh1- и Тh2-лимфоцитов в периферической крови и уровни провоспалительных цитокинов в лохиях родильниц с эндометритом // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005. Т. 140, № 12. С. 622-624.
  7. Amitai G., Adani R., Fishbein E. Bifunctional compounds eliciting anti-inflammatory and anti-cholinesterase activity as potential treatment of nerve and blister chemical agents poisoning // J.Appl.Toxicol. 2006 Vol. 26, N 1.P.81-87.


  8. Asquith B., Zhang Y., Mosley A.J. In vivo T lymphocyte dynamics in humans and the impact of human T-lymphotropic virus 1 infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2007. Vol. 104, N 19. P. 8035-8040.

  9. Georgiev V.St., Albright J.E. Cytokines // Immunomodulation drugs / Ann. of the N.-Y. Acad. Sci. 1993. Vol. 685. P. 284-602.

  10. Kim H.S., Eom J.H., Cho H.Y. Evaluation of immunotoxicity induced by pirimiphos-methyl in male Balb/c mice following exposure to for 28 days // J. Toxicol. Environ. Health. 2007. Vol. 70, N 15-16. P. 1278-1287.

  11. Lenz D.E., Maxwell D.M., Korlovich I. Protection against soman or VX poisoning by human butyrylcholinesterase in guinea pigs and cynomolgus monkeys // 2005. Vol. 157-158. P. 205-210.

  12. Sharp D. Long-term effects of sarin // Lancet. 2006. Vol. 14. N 367 (9505). P.-95-97.

  13. Shin T.M., Kan R.K., McDonough J.H. In vivo cholinesterase inhibitory specificity of organophosphorus nerve agents
    // Chem. Biol. Interact. 2005. Vol. 157-158. P.293-303.

  14. Tremolada P., Finizio A., Villa S. Quantitative inter-specific chemical activity relationships of pesticides in the aquatic environment // Aqat. Toxicol., 2004. Vol. 67. N 1. P. 87-103.