birmaga.ru
добавить свой файл

1
На правах рукописи
ЛЕМСКАЯ НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА

КАРИОТИПИЧЕСКАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ARVICOLINAE


03.00.15 ГЕНЕТИКА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2008

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.


Актуальность проблемы. Изучение генома является одной из актуальных задач генетики. На основании данных по картированию геномов человека и других видов млекопитающих удалось показать, что синтенные группы генов в течение многих миллионов лет сохранились неизменными (Nash, O’Brien 1982).

C помощью методов классической цитогенетики были предложены первые предковые кариотипы для некоторых отрядов и для всего класса млекопитающих (Viegas-Pequignot et al. 1985; Dutrillaux, Couturier 1983; Graphodatsky 1989). Однако из-за внутрихромосомных перестроек многие районы синтении не выявляли видимой цитологической гомологии. Появление метода хромосомного пэйнтинга позволило избавиться от многих ограничений в сравнительных исследованиях. Метод основан на использовании наборов индивидуальных библиотек сортированных или микродиссектированных хромосом (пэйнтинг-проб) разных видов животных. Использование этих наборов в гетерологичной флуоресцентной гибридизации in situ (Zoo-FISH) явилось прорывом в цитогенетике млекопитающих, так как с его помощью стало возможным быстро и эффективно сравнивать геномы филогенетически далеких видов животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что в эволюции большинства таксонов млекопитающих не происходило перераспределения генетического материала между крупными консервативными районами, сохранившимися целиком у современных видов. Можно считать, что эти районы присутствовали и в кариотипе предка плацентарных млекопитающих (Murphy et al. 2001). В то же время в ряде таксонов (Canidae, Hylobatinae, Cricetidae-Muridae) высокая частота хромосомных перестроек приводила к массовой перетасовке предковых синтенных групп и быстрой реорганизации геномов (Графодатский 2001). Cкорость кариотипической эволюции не одинакова в разных таксонах млекопитающих. Практически каждый таксон млекопитающих характеризуется как определенным набором консервативных районов, так и специфическими перестройками между и внутри этих районов.

Настоящая работа посвящена изучению грызунов подсемейства полевковых Arvicolinae (полевки и лемминги) на основе использования метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. Подсемейство представляет значительный интерес межвидовыми контрастами базовых кариотипических характеристик: локализация и размеры блоков С-гетерохроматина, наличие добавочных хромосом, широкая вариабельность диплоидных чисел, нестандартная система определения пола у некоторых видов. Подсемейство Arvicolinae является весьма интересным объектом для исследования закономерностей хромосомной эволюции, так как объединяет виды, обладающие одними из самых перестроенных и быстро эволюционирующих геномов в классе млекопитающих (Ferguson-Smith 1997; Conroy, Cook 1999; Galewski et al. 2006). Кариотипы большинства представителей Arvicolinae описаны с помощью методов классической цитогенетики: рутинной и дифференциальных окрасок. Вследствие значительной перестроенности хромосом выявление гомологичных элементов в кариотипах некоторых видов часто оказывалось затруднительным без применения современных молекулярно-цитогенетических методов, таких как хромосомный пэйнтинг.


Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является исследование кариотипических взаимоотношений полевок подсемейства Arvicolinae.

Для достижения данной цели, были поставлены следующие задачи.



  1. Охарактеризовать кариотипы представителей подсемейства Arvicolinae с помощью пэйнтинг-проб пашенной полевки (Magrestis).

  2. Сравнить хромосомы M. agrestis и копытного лемминга (Dtorquatus) с помощью реципрокного пэйнтинга.

  3. Реконструировать предковые кариотипы для рода Microtus, рода Ellobius и для подсемейства Arvicolinae.

  4. Реконструировать вероятную последовательность преобразований, приведшую к формированию кариотипов современных видов полевковых.

  5. Оценить темпы кариотипической эволюции видов подсемейства Arvicolinae.

Положения, выносимые на защиту.

  1. При сравнении кариотипов видов подсемейства Arvicolinae истинную гомологию некоторых хромосом и хромосомных районов возможно установить только с привлечением сравнительного хромосомного пэйнтинга. Кариотипы современных видов сформированы на основе различных комбинаций гомологичных хромосомных элементов.

  2. Сравнение консервативных элементов в геномах видов подсемейства Arvicolinae и видов из аутгруппы дает возможность реконструировать гипотетический предковый кариотип этого подсемейства и построить схему, отражающую возможный ход кариотипических преобразований, приведших к формированию современных видов.

  3. Темпы эволюции кариотипов в подсемействе Arvicolinae неодинаковы в разных филогенетических ветвях и в среднем значительно выше, чем во многих других таксонах млекопитающих.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые проведено GTG-окрашивание M. dogramacii и L. brandtii. Полученные данные использованы для сравнения этих видов с другими представителями полевковых Arvicolinae.

Впервые проведена гомологичная гибридизация in situ набора сортированных хромосом M. agrestis, что позволило охарактеризовать этот набор пэйнтинг-проб и эффективно использовать его в исследовании кариотипов полевковых Arvicolinae. Хромосомные пробы M. agrestis локализованы на хромосомах 17 других видов полевковых, выявлена межхромосомная гомология кариотипов исследованных видов.

Впервые по результатам пэйнтинга составлена хромосомная карта, включающая сравнение кариотипов 15 видов полевковых Arvicolinae. Это позволило наглядно представить гомологичные ряды хромосом, описать кариотипические преобразования, свойственные представителям этого подсемейства. В дальнейшем такие хромосомные карты могут быть использованы в качестве первичного материала для картирования геномов исследованных видов.

Предложены предковые кариотипы для представителей рода Microtus, рода Ellobius и подсемейства Arvicolinae. Реконструкция предкового кариотипа подсемейства необходима для воссоздания полной картины кариотипической эволюции, приведшей к формированию хромосомных наборов исследуемых ныне живущих видов.


Впервые на основе сравнения истинно гомологичных районов хромосом построено филогенетическое древо, отражающее возможный ход кариотипической эволюции полевковых Arvicolinae. Полученные результаты в совокупности с данными зоологических, палеонтологических и молекулярно-генетических исследований, могут быть полезны для уточнения таксономического положения некоторых видов полевковых, для выявления факторов, обуславливающих хромосомные преобразования, и для оценки скорости кариотипической эволюции видов этого подсемейства.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: 1) Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы». Новосибирск, 26-29 июня 2005 г.; 2) ХV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра". Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005 г.; 3) Динамика генофондов растений, животных и человека. Отчетная конференция. Москва 2005.; 4) Динамика генофондов растений, животных и человека. Отчетная конференция. Москва, ФИАН 2007 г.; 5) V конференция молодых ученых СО РАН, посвященная М.А. Лаврентьеву. Новосибирск, 20-22 ноября 2007г.

Вклад автора. При непосредственном участии автора были получены культуры первичных фибробластов, суспензии метафазных хромосом, проведено C- и G-дифференциальное окрашивание и анализ хромосом значительной части животных, вовлеченных в исследование. Амплификация и мечение зондов, выделение Cot10 ДНК M. rossiaemeridionalis и флуоресцентная in situ гибридизация проводились автором самостоятельно. Автором была проведена локализация пэйнтинг-проб пашенной полевки на хромосомы 16 из 18 видов, вовлеченных в данное исследование. Гомологичная гибридизация пэйнтинг-проб Magrestis и гетерологичная гибридизация с метафазными хромосомами Mrossiaemeridionalis была выполнена сотрудниками лаборатории: Н.А. Сердюковой и к.б.н. Н.В. Рубцовой. Раскладки хромосом для иллюстрации кариотипов M. arvalis, M. rossiaemeridionalis, M. socialis, B. aghanus и C. gud были выполнены ранее к.б.н. О.В. Саблиной (Sablina et al. 2006). Автор принимал также непосредственное участие в обработке, анализе и описании полученных результатов.


Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (160 ссылок) и два приложения. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и содержит 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.


В работе была использована систематика Массера и Карлетона (Musser, Carleton 2005), построенная на основе сопоставления современных данных морфологического, цитогенетического и молекулярного анализа.

Виды, вовлеченные в исследование.

Триба Arvicolini. A. terrestris (amphibius) (ATE) 2n=36; B. afghanus (BAF) 2n=58; C. gud (CGU) 2n=54; L. brandtii (LBR) 2n=34; р. Microtus п/р Alexandromys: M. oeconomus (MOE) 2n=30, группа “clarkei” – M. clarkei (MCL) 2n=50, группа “ maximowiczii ” – M. maximowiczii (MMA) 2n=41; п/р Microtus: группа “agrestis” – M. agrestis (MAG) 2n=50, группа “arvalis” – M. arvalis хромосомная форма “arvalis” (MARA) 2n=46, M. rossiaemeridionalis (levis) (MRO) 2n=54; группа “socialis” – M. dogramacii (MDO) 2n=48, M. guentheri guentheri (MGUG) 2n=54, M. socialis (MSO) 2n=62; р. Microtus п/р StenocraniusM. gregalis (MGR) 2n=36; р. Microtus п/р Terricola группа “subterraneus” – M.daghestanicus (MDA) 2n=54.

Триба Dicrostonychini. D. torquatus (DTO) 2n=45+B.

Триба Ellobiusini. р. Ellobius: п/р AfganomysE. lutescens (ELU) 2n=17, п/р Ellobius – E. talpinus (2n=54).


Триба Myodini. р. Eothenomys: E. proditor (EPR) 2n=32, E. miletus (EMI) 2n=56. р. Clethrionomys (Myodes) – C. rutilus (CRU)2n=56.

Культуры клеток и суспензии метафазных клеток.

Культивирование клеток, получение суспензий метафазных клеток и приготовление препаратов проводили по стандартным методикам (Графодатский, Раджабли 1988; Henegariu et al. 2001; Nesterova et al. 2004) с небольшими модификациями. Суспензия хромосом E. lutescens предоставлена д.б.н. Баклушинской И.Ю. и д.б.н. Ляпуновой Е.А.



Дифференциальное окрашивание хромосом. GTG-окрашивание проводили по методике Сибрайт (Seabright 1971), С-окрашивание проводили по методике Самнера (Samner 1972). Оба метода были немного модифицированы (Графодатский, Раджабли 1988).

Хромосомный пэйнтинг проводили на дифференциально окрашенных метафазных хромосомах по методу Янга (Yang et al. 1995) с небольшими модификациями. В работе использовали Cot10 ДНК M. rossiaemeridionalis. Все используемые в работе пэйнтинг-пробы предоставлены группой ветеринарной цитогенетики Кембриджского университета (Англия): проф. Фергюсон-Смит, д-р Янг, д-р О’Брайен.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Локализация хромосомных проб Microtus agrestis на хромосомы видов подсемейства Arvicolinae.

Кариотипы полевковых Arvicolinae были проанализированы при помощи хромосомоспецифичных пэйнтинг-проб M. agrestis (2n=50). FISH проводили с супрессией повторенных последовательностей ДНК, поэтому сравнительный анализ результатов пэйнтинга отражает гомологию только эухроматиновых районов хромосом. Номенклатура хромосом в кариотипах большинства исследованных видов соответствует номенклатурам, приведенным в “Атласе кариотипов млекопитающих” (Sablina et al. 2006). Порядок расположения хромосом в кариотипах M. agrestis и M. oeconomus приведен согласно описанию Модая (Modi 1987).

Кариотип M. oeconomus занимает важное место в настоящем исследовании. Ранее в нашей лаборатории на хромосомы M. oeconomus были локализованы хромосомные пробы Mesocricetus auratus и Mus musculus. В данной работе на основе хромосомного пэйнтинга была установлена гомология всех хромосомных элементов кариотипа M. oeconomus с хромосомами M. agrestis (Рис. 1). Совокупность полученных данных позволила сравнить виды подсемейства Arvicolinae с видами подсемейства Cricetinae.

Рисунок 1. GTG-окрашенные метафазные хромосомы M. oeconomus. Вертикальными линиями показана локализация соответствующих хромосомных проб M. agrestis (MAG), M. auratus (MAU) и M. musculus (MMU) на хромосомы M. oeconomus.

Для подтверждения точности прямой локализации хромосомных проб M. agrestis на хромосомы D. torquatus был проведен обратный пэйнтинг с использованием хромосомных проб D. torquatus (Рис. 2). Не было выявлено дополнительных внутрихромосомных перестроек. Данные анализа позволили установить точки эволюционных разрывов в хромосомах исследованных видов.

Рисунок 2. GTG-окрашенные метафазные хромосомы M. agrestis. Вертикальными линиями показана локализация соответствующих хромосомных проб D. torquatus.

С помощью пэйтинг-проб Microtus agrestis были проанализированы кариотипы 17 видов из 8 родов подсемейства Arvicolinae: 9 видов из рода Microtus, 2 вида из рода Ellobius и по одному виду из родов Blanfordimys, Lasiopodomys, Clethrionomys, Chionomys, Arvicola и Dicrostonyx. Установлена гомология всех хромосом Magrestis с хромосомными элементами кариотипов исследованных видов.

Дополнительно был проведен анализ результатов сравнительного хромосомного пэйнтинга между тремя видами полевок: M. clarkei (род Microtus), E. proditor и E. miletus (род Eothenomys) (Li et al. 2006). Сопоставление GTG-исчерченности хромосом этих видов с хромосомами M. agrestis позволило включить их в общую схему кариотипических преобразований полевковых Arvicolinae на основании гомологии хромосомных элементов.


Совокупные данные, полученные при сравнительном хромосомном анализе 21 вида из 9 родов полевковых, представлены в итоговой таблице (Табл. 1). В ней отражены все ассоциации и разрывы хромосомных элементов M. agrestis (MAG), характерные для кариотипов исследованных видов. Для каждого вида в верхней правой строке приведены ассоциации, в нижней правой строке – разрывы хромосомных элементов M. agrestis.

Таблица 1. Ассоциации и разрывы хромосомных элементов M. agrestis, выявленные в кариотипах исследованных видов.


A. terrestris

2/8, 1/17, 1/7, 11/13, 9/12, 6/21, 5/22, 10/14, 8/23,19/20

MAG1®2, MAG8®2, MAG9®2

B. afghanus

2/8

MAG1®2, MAG8®2, MAG9®2, MAG4®2, MAG5®2

C. gud

2/8, 1/17

MAG1®2, MAG8®2, MAG9®2, MAG17®2

C. rutilus*

2/10

MAG1®2, MAG8®2, MAG9®2, MAG2®2, MAG10®2


D. torquatus

2/8, 1/7, 14/17/23, 8/11, 1/9, 18/12/6, 4/19

MAG1®3, MAG8®2, MAG9®2, MAG4®2, MAG17®2, MAG24®2

E. lutescens*

11/13/19/6, 2/8/14/4, 12/17/10/9/23, 1/5, 3/24/10/7/19/10/11/9/15/16/8, 21/22/16/11/2, 20/18/1

MAG1®2, MAG8®2, MAG9®2, MAG2®2, MAG10®3, MAG11®3,MAG16 ®2

E. talpinus*

8/14, 9/23, 1/5, 17/9, 3/8

MAG1®3, MAG8®2, MAG9®2, MAG3®2, MAG5®2, MAG14®2

E. miletus*



MAG12, MAG82, MAG92

E. proditor*

3/8, 9/12, 4/18, 9/19, 1/6, 2/13, 5/23, 7/16, 10/15, 14/20, 11/21, 17/22

MAG12, MAG82, MAG92

L. brandtii*


8/11, 1/9, 1/12, 4/5, 10/13, 12/21, 17/23/15, 6/18, 6/20/8, 14/24, 19/22

MAG12, MAG82, MAG92, MAG42, MAG62

M. clarkei

2/8,3/5

MAG12, MAG82, MAG92

M. oeconomus

2/8/1, 14/17, 9/12, 4/18, 20/10, 22/23, 11/1, 13/5, 15/7, 8/6, 19/16, 9/21

MAG13, MAG82, MAG92

M. maximowiczii

2/8, 17/9, 4/18, 20/10, 22/23, 8/19, 3/4/15, 5/14

MAG12, MAG82, MAG92, MAG42

M. arvalis

2/8, 6/3, 10/5, 4/7

MAG82, MAG92

M. rossiaemeridionalis

2/8

MAG12, MAG82, MAG92

M. socialis

2/8

MAG12, MAG82, MAG92, MAG23, MAG32, MAG62


M. guentheri

2/8

MAG12, MAG82, MAG92

M. dogramacii

2/8, 3/24, 8/19, 22/18

MAG12, MAG82, MAG92

M. gregalis

2/8, 9/18/12, 9/19, 21/16/6, 8/22/24, 15/17, 20/23

MAG12, MAG82, MAG92

M. daghestanicus

2/8

MAG12, MAG82, MAG92

Стрелками в таблице обозначено разделение определенной хромосомы M. agrestis (MAG) на соответствующее число фрагментов (цифры курсивом). Знаком * – отмечены виды, в кариотипах которых отсутствует ассоциация 2/8. Жирным шрифтом в таблице обозначена характерная для большинства видов хромосомная ассоциация 2/8, а также общие для кариотипов всех исследованных видов разрывы хромосом Magrestis. Очевидно, в предковом кариотипе каждая хромосома, соответствующая MAG1, MAG8 и MAG9, была представлена несколькими хромосомными сегментами. И только в ходе эволюции Magrestis произошли слияния соответствующих элементов с образованием хромосом MAG1, MAG8 и MAG9.

Полученные данные свидетельствуют о том, что кариотипы современных полевковых чаще формировались за счет слияния базовых элементов в разных комбинациях. При этом кариотипы некоторых видов (например, D. torquatus, B. afghanus, M. socialis) формировались также за счет разрывов элементов, гомологичных M. agrestis. Самое большое число слияний и разрывов элементов, гомологичных M. agrestis, характерно для E. lutescens. Этот вид можно рассматривать как пример “кариотипической революции”. В то же время некоторые виды рода Microtus (Mdaghestanicus, M. guentheri, M. rossiaemeridionalis) характеризуются одинаковыми ассоциациями и разрывами элементов, гомологичных хромосомам M. agrestis. Отличия кариотипов выявляются только при дополнительном исследовании GTG-исчерченности хромосом (Табл. 2).

Реконструкция предковых кариотипов.

На основании результатов сравнительного хромосомного пэйнтинга был реконструирован гипотетический предковый кариотип подсемейства Arvicolinae – AAK (Ancestral Arvicolinae Karyotype) (Рис. 3).

Для построения предкового кариотипа было выбрано 2 аутгруппы – Calomiscus sp. и P. eremicus (базальный вид для подсемейств Arvicolinae и Cricetinae). На хромосомы этих видов была проведена локализация хромосомных проб M. auratus и M. musculus. На основе локализации хромосомных проб MAG, MAU и MMU на хромосомы Moeconomus (Рис. 1) кариотипы видов аутгрупп Calomiscus sp. и P. eremicus были представлены через хромосомные элементы M. agrestis. Установлено, что ассоциация MAG2/8 присутствует в обеих аутгруппах, но отличается от MAG2/8 современных полевок по фрагменту MAG2. У базального вида D. torquatus ассоциация MAG2/8 представлена в форме, характерной для других Arvicolinae. Ассоциация 1/9 представлена в кариотипах D. torquatus и P. eremicus элементами, гомологичными разным районам MAG9. Поэтому эта ассоциация отсутствует в кариотипе гипотетического предка Arvicolinae.

Рисунок 3. Гипотетический предковый кариотип подсемейства полевковых Arvicolinae.

На основе анализа кариотипов исследованных видов было выдвинуто предположение, что в состав предкового кариотипа рода Microtus входило 54 хромосомы. Предковый кариотип серых полевок мог сформироваться из AAK слиянием AAK28+AAK29 (MAG24), AAK26+AAK15 (фрагмент MAG1), AAK27+AAK16 (MAG4). Все остальные элементы AAK, включая AAK1 (гомолог MAG2/8), присутствовали у предка рода Microtus.

По результатам анализа геномов двух видов был построен предковый кариотип для рода Ellobius (AEK). В качестве аутгруппы использовали кариотип M. oeconomus и M. auratus. Было высказано предположение, что кариотип предка слепушонок, мог сформироваться из AAK путем одного разрыва AAK1 (MAG2/8) и трех слияний AAK28+AAK29 (MAG24), AAK26+AAK15 (MAG1), AAK27+AAK16 (MAG4). Таким образом, в состав AEK, вероятно, входило 56 хромосом. Кариотип предка рода Ellobius, по-видимому, был похож на кариотип современного Clethrionomys rutilus.

На основании результатов сравнительного хромосомного пэйнтинга была установлена гомология хромосом 18 видов полевковых и 3 вида были привлечены в исследование из литературных источников (Li et al. 2006). Таким образом, установлена гомология хромосом для 21 вида подсемейства полевковых Arvicolinae. Была составлена сравнительная хромосомная карта, в которую вошли хромосомы 15 видов полевковых. Фрагмент карты представлен на рисунке 4, где показаны ряды хромосом, гомологичных MAG1, MAG2, MAG7, MAG8 и MAG15.

Рисунок 4. Сравнительная карта хромосом 15 видов полевковых Arvicolinae (фрагмент карты).


При помощи хромосомных ассоциаций M. oeconomus все хромосомные ассоциации видов подсемейства полевковых, исследованных в данной работе, были представлены в хромосомных сегментах Calomiscus sp. Совместно с Романенко С.А. для 52 видов мышевидных грызунов (21 вид полевковых проанализирован в данной работе) построена матрица (52 вида) x (357 перестроек), в которой независимые перестройки обозначались в двоичной системе (1 – перестройка присутствует, 0 – перестройка отсутствует). Матрица была проанализирована в лаборатории Г. Добиньи (Национальный музей истории природы, происхождения, структуры и эволюции биоразнообразия, Париж) методом максимальной вероятности при помощи программного обеспечения POUP 4.01b (Swofford, 1998). На основании данных матрицы было построено филогенетическое древо мышевидных грызунов. Однако подсемейство Arvicolinae практически не распалось на независимые ветви. Возможно, это связано с тем, что кариотипы всех видов полевковых состоят из достаточно крупных консервативных элементов, представленных в разных комбинациях. В некоторых случаях сходные перестройки повторяются в независимых ветвях древа.

Возможный ход эволюции подсемейства полевковых. Скорость кариотипической эволюции.

Для реконструкции хода кариотипической эволюции видов подсемейства Arvicolinae, был проведен дополнительный анализ GTG-окрашенных хромосом. При этом учитывали не только общие слияния и разрывы хромосом, но и рисунок G-бэндинга и морфологию маркерных хромосомных элементов. В качестве маркерных были выбраны хромосомные элементы, которые наиболее часто участвуют в эволюционных преобразованиях кариотипов полевковых. Для исследуемых видов – это хромосомные элементы, гомологичные хромосомам MAG2, MAG8 и MAG9 (Табл. 2).

Построение филогенетического древа, отражающего ход кариотипическиой эволюции полевковых (Рис. 5), проводили в соответствии с принципами кладистического анализа. В качестве аутгруппы при построении древа использовали Calomiscus sp. При этом за основу были приняты схемы дивергенции, построенные на основании молекулярных данных (Jaarola et al. 2004; Galewski et al. 2006).

В базальной ветви вместе с D. torquatus находится L. brandtii, поскольку они имеют сходный рисунок GTG-бэндинга хромосомного элемента, гомологичного MAG8б (1), одинаковые хромосомные ассоциации, гомологичные MAG8/11 и MAG1/9. Также у этих видов, как и у гипотетического предка, есть разрыв хромосомы, гомологичной MAG4, то есть в кариотипах в интактном виде сохранились AAK16 и AAK27.

Для видов трибы Myodini и Ellobiusini, обособленных в отдельную ветвь, характерно отсутствие маркерного элемента, гомологичного MAG2/8. Ассоциации хромосом MAG1/5, MAG8/14, MAG9/23 являются характерными только для кариотипов видов рода Ellobius.

Далее представлена группа видов трибы Arvicolini, в кариотипах которых присутствует элемент, гомологичный MAG2/8. Анализ GTG-исчерченности этого элемента и хромосомного элемента, гомологичного MAG8б, позволяет разделить виды по группам (Табл. 2). Обособленно на древе раположена A. terrestris, поскольку хромосомный элемент, гомологичный MAG2/8, имеет уникальный рисунок GTG-исчерченности (2/8 (7)). Виды B. afghanus и С. gud объединены общими хромосомными элементами, гомологичными MAG2/8 (1) и MAG8б (3).

Следующая ветвь представлена видами рода Microtus. Базально расположен M. gregalis, который обособлен на основании молекулярных данных (Jaarola et al. 2004). Для видов подрода Alexandromys (M. clarkei, M. oeconomus, M. maximowiczii) и M. daghestanicus (подрод Terricola) маркерным является хромосомный элемент 2/8 (2). Однако на основании молекулярных данных виды подрода Terricola относят к базальным для таксономической группы “arvalis” и “socialis” (Jaarola et al. 2004).


Таблица 2. Типы маркерных хромосом подсемейства полевковых Arvicolinae.



Хромо-сомный элемент кариотипа

M. agrestis

Схемы гомеологичных хромосом в кариотипах видов Arvicolinae


MAG2


MAG8а

(2/8)




1



2



3



4



5



6



7



8



9

10


DTO, CGU,

BAF


MOE

(1/8/2),


MDA

MCL

MMA

MARA,

MGR


MRO

ATE

MDO

MGU

MSO

MAG8б


1





2








3


4


5


6


DTO (8/11),

ATE (8/23),

CRU, EMI,

EPR (8/3)



LBR

(8/11)

MOE

(8/6),


MCL,

MGR,






MMA

8/19),


MDO

CGU,

BAF,


MSO

MGUG

MARA


MRO

MAG9


1


2


3


4


MAG

MSO

MDO


MMA

DTO

ATE


BAF, CGU, CRU, EMI, EPR, MAR, MCL, MDA, MGR, MGU, MOE, MRO

Волнистая линия (~) в нижней части схемы хромосомных элементов обозначает тандемное слияние.

Далее в тексте и на схеме филогенетического древа тип соответствующей маркерной хромосомы обозначен в скобках, например, 2/8 (1).

Рисунок 5. Филогенетическое древо подсемейства Arvicolinae.

Маркерным хромосомным элементом для ветви общественных полевок “socialis” является акроцентрическая хромосома MAG2/8 (8), а для группы “arvalis” – субметацентрик 2/8 (5). Эти элементы отличаются от 2/8 (1) транспозициями центромер. Отсутствие в кариотипе вида M. agrestis синтенной ассоциации 2/8, послужило основанием к его обособлению от других представителей подрода Microtus.

Для кариотипа каждого исследованного вида было определено минимальное число хромосомных перестроек, отделяющих его от гипотетического предкового кариотипа подсемейства Arvicolinae. Самое большое число перестроек относительно предка, равное 33, было выявлено в кариотипе слепушонки E. lutescens. Самое меньшее число перестроек, выявленное в исследованных кариотипах, равно 3 (AAK28+29, 26+15, 27+16). Столько перестроек было обнаружено у M. rossiaemeridionalis и M. guentheri (подрод Microtus), и у M. daghestanicus (подрод Terricola). Исходя из средних значений времени дивергенции видов в подсемействе Arvicolinae (Chaline et al. 1988) была проведена оценка темпов эволюции кариотипов. Среднее значение скорости кариотипических преобразований для 21 вида полевковых составило 1.8-3 хромосомные перестройки за 1 млн. лет. Это примерно в 10 раз выше средней скорости кариотипической эволюции млекопитающих (O`Brien et al. 1999).

При изучении подсемейства полевковых возникает вопрос о том, что же явилось более значимым для их дивергенции: повсеместное распространение животных и как следствие адаптивное преобразование хромосом, или же наоборот, высокая скорость эволюции кариотипов, приведшая к широкому заселению ареала и бурной эволюции. К сожалению, на сегодняшний день нет достаточных доказательств преобладания того или иного пути эволюционных преобразований.

Существование политипических видов (M. arvalis, M. mawimowiczii, M. dogramacii и др.), “робертсоновских вееров” (E. talpinus), подвидов внутри одного вида (M. g. guentheri и др.), представителей со спорным видовым статусом (B. afghanus) является отражением высокого уровня межвидовой и внутривидовой кариотипической вариабельности в пределах подсемейства Arvicolinae. На этом основнии можно предположить, что эволюционный процесс у полевковых находится в активной фазе и что в данный момент идет период накопления хромосомных перестроек. Возможно, в будущем это приведет к выделению отдельных независимых видов на базе современных подвидов и хромосомных форм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.


Пэйнтинг-пробы хромосом M. agrestis оказались достаточно эффективным инструментом для анализа кариотипов Arvicolinae. В данной работе при помощи гетерологичного хромосомного пэйнтинга и сравнительного анализа GTG-окрашенных хромосом была проведена реконструкция кариотипа гипотетического предка полевковых. Однако для полной картины требуются дополнительные исследования с вовлечением большего числа видов. Это позволит более детально реконструировать состав предкового кариотипа подсемейства Arvicolinae, выявить новые базисные ассоциации и маркерные хромосомы, определить точки, по которым наиболее часто происходят разрывы.

Очевидно, что невозможно установить истинную гомологию хромосом без вовлечения сравнительного пэйнтинга. С другой стороны, при построении филогенетического древа полевковых методом кладистического анализа и максимальной парсимонии на основании данных гибридизации in situ, ограничение метода ZOO-FISH не позволило учитывать значение транспозиций центромер и визуализируемых внутрихромосомных инверсий. Комплексное использование результатов пэйнтинга и сравнения GTG-окрашенных хромосом позволило преодолеть недостатки методов и в целом добиться необходимого результата, достаточного для построения филогенетического древа, отражающего возможный ход хромосомной эволюции полевковых.


ВЫВОДЫ.


  1. На основании хромосомного пэйнтинга и сравнения GTG-окрашенных хромосом, установлена гомология всех хромосомных элементов кариотипа M. agrestis и кариотипов 20 видов, представителей 9 родов подсемейства полевковых Arvicolinae. Кариотипы современных видов подсемейства формировались за счет слияний и разрывов достаточно крупных консервативных хромосомных элементов.
  2. Реципрокный пэйнтинг между хромосомами M. agrestis и D. torquatus, позволил уточнить точки разрывов хромосом обоих видов, возникших в ходе эволюции. Гомология В-хромосом D. torquatus с хромосомами M. agrestis не была выявлена.


  3. Реконструирован гипотетический предковый кариотип подсемейства полевковых Arvicolinae. Идентифицированы маркерные слияния предковых элементов хромосом, которые могли привести к формированию предкового кариотипа рода Microtus и предкового кариотипа рода Ellobius. Определено минимальное число хромосомных перестроек, отделивших кариотипы исследованных видов от кариотипа гипотетического предка.

  4. На основании принципов кладистического анализа построено филогенетическое древо полевковых, отражающее возможный ход кариотипических преобразований.

  5. Проведена оценка темпов эволюции кариотипов подсемейства Arvicolinae. Среднее значение скорости реорганизации кариотипов составляет 1.8-3 хромосомные перестройки за 1 млн. лет (без учета инверсий). Наибольшее число перестроек произошло при формировании кариотипа горной слепушонки E. lutescens, наименьшее – у видов подродов Microtus и Terricola (род Microtus).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.


  1. Sitnikova N.A., Romanenko S.A., O'Brien P.C., Perelman P.L., Fu B., Rubtsova N.V., Serdukova N.A., Golenishchev F.N., Trifonov V.A., Ferguson-Smith M.A., Yang F., Graphodatsky A.S. Chromosomal evolution of Arvicolinae (Cricetidae, Rodentia). I. The genome homology of tundra vole, field vole, mouse and golden hamster revealed by comparative chromosome painting. // Chromosome Res. 2007. V. 15(4). P. 447-456.
  2. Romanenko S.A., Sitnikova N.A., Serdukova N.A., Perelman P.L., Rubtsova N.V., Bakloushinskaya I.Y., Lyapunova N.A., Just W., Ferguson-Smith M.A., Yang F., Graphodatsky A.S. “Chromosomal evolution of Arvicolinae (Cricetidae, Rodentia)). II. The genome homology of two mole voles (genus Ellobius), the field vole and golden hamster revealed by comparative chromosome painting. // Chromosome Res. .2007. V. 15(7). P. 891-897.


  3. Графодатский А.С., Трифонов В.А., Перельман П.Л., Романенко С.А., Билтуева Л.С., Беклемишева В.Р., Сердюкова Н.А., Воробьева Н.В., Юдкин Д.В., Рубцова Н.В., Соколовская Н.В., Ситникова Н.А., Нестеренко А.И.. Филогеномика млекопитающих: цитогенетические аспекты. // Происхождение и эволюция биосферы. Материалы международного рабочего совещания. 2005. Новосибирск. С. 269.

  4. Графодатский А.С., Трифонов В.А., Перельман П.Л., Романенко С.А., Билтуева Л.С., Беклемишева В.Р., Сердюкова Н.А., Воробьёва Н.В., Юдкин Д.В., Рубцова Н.В., Соколовская Н.В., Ситникова Н.А., Нестеренко А.И.. Эволюция геномов млекопитающих: цитогенетические аспекты. // Структура и функции клеточного ядра. Материалы ХV Всероссийского совещания. 2005. С.-П.. С. 805.

  5. Графодатский А.С., Беклемишева В.Р., Билтуева Л.С., Воробьёва Н.В., Нестеренко А.И., Перельман П.Л., Романенко С.А., Рубцова Н.В., Сердюкова Н.А., Ситникова Н.А., Трифонов В.А., Юдкин Д.В. Разнообразие геномов млекопитающих и внутривидовой полиморфизм: молекулярно-цитогенетические подходы к изучению. // Тез. докл. отчетной конф. «Динамика генофондов растений, животных и человека». 2005. Москва, ФИАН. С. 31.

  6. Трифонов В.А., Юдкин Д.В., Беклемишева В.Р., Билтуева Л.С., Воробьёва Н.В., Нестеренко А.И., Перельман П.Л., Романенко С.А., Рубцова Н.В., Сердюкова Н.А., Ситникова Н.А., Графодатский А.С. Разнообразие геномов млекопитающих и внутривидовой полиморфизм: молекулярно-цитогенетические подходы к изучению. // Тез. докл. отчетной конф. «Динамика генофондов растений, животных и человека». 2007. Москва, ФИАН. С. 32.

  7. Юдкин Д.В., Романенко С.А., Ситникова Н.А., Нестеренко А.И. Сравнительная и молекулярная цитогенетика млекопитающих. // Тез. докл. отчетной конф. «V конференция молодых ученых СО РАН, посвященная М.А. Лаврентьеву». 2007. Новосибирск. С. 113-115.